人字果屬植物藥用親緣學探討△

何春年，李珮，郝大程，肖培根*

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.大連交通大學 環(huán)境化工學院 生物技術研究所，遼寧 大連 116028

人字果屬（DichocarpumW.T.Wang &P.K.Hsiao）植物為毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物[1]。該屬植物分布具有地理局限性，為東亞大陸所特有，共有約18 個種2 個變種（The Plant List Database，http://www.theplantlist.org/），主要分布在中國、日本、印度錫金、尼泊爾、緬甸北部。該屬植物在中國約有11 種，分布在重慶、云南、貴州、四川、湖北和臺灣等地[2]。人字果屬植物一般生長在海拔300～1800 m 的山谷陰暗潮濕處，具有鳥趾狀復葉或一回三出復葉，該屬植物的特點是有心皮2 枚，基部合生，蓇葖果狹長圓形至線形，通常呈倒人字型展開[3]。多種人字果屬植物具有傳統(tǒng)藥用記載。據(jù)《中華本草》描述，基葉人字果D.basilareW.T.Wang&P.K.Hsiao在四川省筠連縣又名“地五加”，全草入藥，可用于治療風濕水腫[4]。蕨葉人字果D.dalzielii(J.R.Drummond &Hutchinson) W.T.Wang &P.K.Hsiao 在貴州省又名“巖節(jié)連”，其根狀莖入藥，功效為清熱解毒、消腫止痛，外用可治療紅腫瘡毒和勞傷腰痛[5]，2015 年，貴州食品藥品監(jiān)督管理局將蕨葉人字果列為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》中的新增補藥材品種[6]。

本課題組自20世紀80年代以來，對毛茛科植物進行了一系列的藥用親緣學研究[7]，如毛茛屬、烏頭屬、唐松草屬、耬斗菜屬和升麻屬等[8]。本研究以毛茛科人字果屬類群為研究對象，對其藥用親緣關系（傳統(tǒng)應用-植物化學成分-藥理活性）進行總結(jié)歸納，以期對該屬植物的保護和藥用資源開發(fā)提供參考。

1 人字果屬植物系統(tǒng)學

1742 年，瑞典生物學家Linné 建立了扁果草屬（IsopyrumL.）[1]。1964 年，肖培根和王文采依據(jù)外部形態(tài)特征（蜜葉、葉片、心皮和種子）從扁果草屬中劃分出1個包含16個新種或新組合的植物新屬：人字果屬[1]。人字果屬植物花的構造和星果草屬（AsteropyrumJ.R.Drumm.&Hutch.）及黃連屬（CoptisSalisb.）相似，特別是蜜葉和瓣片；黃連屬植物鳥趾狀分裂的葉片也和人字果屬較為相似；人字果屬植物的花與這2 個屬的區(qū)別只在于心皮。此外，薄層色譜結(jié)果顯示，人字果屬植物中含有芐基異喹啉類生物堿，與黃連中的化學成分較為相似。從系統(tǒng)發(fā)育關系和化學成分上來看，人字果屬和黃連屬的親緣關系非常接近，前者可能是由后者演化而來[3]。隨后，F(xiàn)u[9]對人字果屬植物的形態(tài)、花粉和染色體等特征進行了研究，發(fā)現(xiàn)了人字果屬植物染色體基數(shù)可能為6，該屬中存在著2種花粉類型，即三溝和散溝。Fu 等[9]認為，與黃連屬相比，人字果屬與毛茛科中另一存在散溝花粉的星果草屬親緣關系較近，提議將人字果屬放入星果草族（Asteropyreae）或單獨成立人字果族（Dichocarpyreae）。而日本學者Tamura[10]則認為，人字果屬可能起源于毛茛科的擬扁果草屬（EnemionRaf.），兩者有較近的親緣關系。

植物分子生物學的飛速發(fā)展為人字果屬的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了更直接的理論依據(jù)。1995 年，Kosuge 等[11]從毛茛科17 屬23 種植物和小檗科1 種植物中擴增了adh核編碼基因片段，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，人字果屬與黃連屬親緣關系較遠，與唐松草屬、扁果草屬和擬扁果草屬親緣關系較近。2005 年，Wang 等[12]基于分子水平（葉綠體基因rbcL和部分核基因26S rDNA序列）對星果草屬的系統(tǒng)位置進行了研究，結(jié)果表明，星果草屬和人字果屬分屬于毛茛亞科（Ranunculoideae）和唐松草亞科（Thalictroideae）。2007 年，Wang 等[13]利用葉綠體基因（matK、rbcL和trn L-F）和核基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）重建了唐松草亞科的系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步支持了人字果屬屬于唐松草亞科的觀點，并認為扁果草屬和擬扁果草屬是人字果屬的姊妹屬。2016 年，Cossard 等[14]利用來自3 個基因組的8 個分子標記對毛茛科植物進行研究，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，人字果屬和扁果草屬是姊妹屬。2017年，Xiang等[15]利用葉綠體基因（matK、trnL-F和trnH-psbA）和核基因ITS 的組合片段，對人字果屬植物17 個種的分子地理學進行了研究。日本學者Tamura[16]對人字果屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，該屬是包含2 個分支的單系類群，2 個分支均具有較高的支持率，分支Ⅰ為日本人字果組，分支Ⅱ包括人字果組和縱肋人字果組。該研究還選擇了唐松草亞科9個屬的9個種作為外類群，結(jié)果表明，人字果屬是扁果草屬和擬扁果草屬的姊妹屬。

人字果屬下分類系統(tǒng)也經(jīng)歷了幾次變化。該屬首次建立時，肖培根和王文采依據(jù)花托在果期的膨大程度和形狀將屬下劃分為2 個組（人字果組Sect.Dichocarpum和日本人字果組Sect.Hutchinsonia）和2 個系，包括16 個種。人字果組植物的花托在果期不膨大或微增大，組下劃分為人字果系和縱肋人字果系，其中包括了中國的9 個種；日本人字果組植物的花托在果期膨大，底部凹陷[3]。1988 年，F(xiàn)u[9]將人字果屬的15 個種3 個變種劃分在2 個組：人字果組和日本人字果組，將人字果組由原來的2 個系分為3 個系：人字果系Ser.Dichocarpum、蕨葉人字果系Ser.Dalzieliana和縱肋人字果系Ser.Fargesiana；將日本人字果組也分為了3 個系：日本人字果系Ser.Hutchinsonia、糙籽人字果系Ser.Trachysperma和匐莖人字果系Ser.Stolonifera。其中，中國的8 個種2 個變種歸在人字果組。1968—1995 年，Tamura[16]對人字果屬的分類進行了一系列研究，將人字果屬分為3 個組（人字果組Sect.Dichocarpum、縱肋人字果組Sect.Fargesia和日本人字果組Sect.Hutchinsonia）、4個亞組和2個系，包括19個種，其中10 個種分布在中國地區(qū)，屬于人字果組和縱肋人字果組。本課題組基于DNA 條形碼ITS2 構建人字果屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，人字果屬與擬扁果草屬和扁果草屬親緣關系較近，人字果屬下的人字果組和縱肋人字果組親緣關系較遠[17]。

近年來，人字果屬有3 個新種被正式發(fā)表。2015 年，王文采等[18]發(fā)表了產(chǎn)于中國云南省的新種裂瓣人字果D.lobatipetalumW.T.Wang &Bing Liu。但Xie等[19]對麻栗坡人字果、裂瓣人字果和粉背葉人字果的模式標本進行了比較，認為這3 個種屬于同一個種，都來自滇東南（相鄰的麻栗坡縣和西疇縣），具有共同的特征，即有相對較大且背面有白霜的小葉。2016 年，Jiang 等[20]發(fā)表了產(chǎn)于貴州省的務川人字果D.wuchuanenseS.Z.He。2020年，Nguyen等[21]發(fā)表了位于越南北部的河江（Ha Giang）省的1個新種：河江人字果D.hagiangenseV.T.Pham,sp.Nov。這些新發(fā)表的種在人字果屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育位置還未有定論。

2 化學成分

目前從人字果屬植物中僅分離得到16 個化合物。吳敏[22]從開陽人字果D.kaiyangenseS.Z.He &Y.C.Li,sp.nov.中分離到了二十九烷十醇[（10S）-nonacosan-10-ol]、開陽人字果素A（kaiyangense A）、胡蘿卜苷（daucosterol）、caleoside D 和安徽銀蓮花苷（anhuienoside B）。本課題組從耳狀人字果D.auriculatum(Franchet)W.T.Wang&P.K.Hsiao 中分離到了11個化合物，包括4個芐基異喹啉生物堿：小檗堿（berberine）、木蘭花堿（magnoflorine）、千金藤坡寧（steponine）和藥根堿（jatrorrhizine）；2 個氰苷：蝙蝠葛苷元（coclauril）和蝙蝠葛氰苷（menisdaurin）；2 個內(nèi)酯：蝙蝠葛內(nèi)酯（menisdau rilide）和耬斗菜內(nèi)酯（aquilegiolide）；2 個倍半萜苷：（6R，9S）-3-酮基-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷[（6R，9S）-3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside]和布盧竹柏醇C-葡萄糖苷（blumenol C-glucoside）及十六烷酸（palmitic acid）[23]。

本課題組采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）對采集到的10 種人字果組（Sect.Dichocarpum）植物及4種外類群植物的代謝產(chǎn)物進行了分析比較，結(jié)果顯示，人字果屬植物與擬扁果草（擬扁果草屬）、耬斗菜（耬斗菜屬）、尖葉唐松草（唐松草屬）和黃連（黃連屬）這4 種外類群植物的代謝物輪廓差異顯著。對這10 種人字果屬植物的化學成分進行了在線鑒定，共鑒定出128 個代謝物，包括生物堿、黃酮、酚酸、三萜皂苷、內(nèi)酯、氰苷類化合物等，并根據(jù)代謝產(chǎn)物二級質(zhì)譜（MS/MS）譜圖之間的相似性，構建了人字果屬植物化學成分的分子網(wǎng)絡，從中揭示了3 個化合物家族：異喹啉生物堿、以山柰酚為骨架的黃酮醇苷及三萜皂苷。進一步基于化學成分信息進行了主成分和聚類分析，結(jié)果顯示，所有樣品能夠明顯地分為3 個組；木蘭花堿為該屬植物普遍含有的特征性成分；黃酮類化合物，特別是黃酮和黃酮醇苷，普遍分布在人字果組的每個種中；耳狀人字果中含有較多異喹啉生物堿（阿樸菲型和原小檗堿型）；裂瓣人字果中鑒定出了較多的雙芐基異喹啉生物堿；三萜皂苷類化合物主要分布于開陽人字果和縱肋人字果中[17]。

3 傳統(tǒng)藥用和現(xiàn)代藥理作用

通過查閱本草圖書資料、國內(nèi)植物標本館數(shù)據(jù)庫及已發(fā)表的相關文獻，對人字果屬植物的傳統(tǒng)藥物學進行了總結(jié)。人字果屬植物藥用種的分布地區(qū)、異名（俗名）、藥用部位、民間傳統(tǒng)療效見表1。

表1 人字果屬藥用植物分布與傳統(tǒng)功效

本課題組采用Ellman 法對9 種人字果屬植物樣品的水提物和甲醇提取物進行了乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制活性篩選[25]，結(jié)果表明，不同種的提取物對AchE普遍具有抑制作用，其中耳狀人字果的抑制作用最強，具有抑制活性的次生代謝物主要集中于根部。進一步對分離得到的小檗堿、木蘭花堿、藥根堿、千金藤坡寧、蝙蝠葛氰苷和其他7個在近緣屬中分布的異喹啉生物堿進行了AchE 抑制活性篩選，結(jié)果顯示，小檗堿、藥根堿、千金藤坡寧、非洲防己堿、黃柏堿、蝙蝠葛堿、巴馬汀都具有較好的AchE抑制活性，非洲防己堿［半數(shù)抑制濃度（IC50）=0.24 μmol·L-1］和巴馬汀（IC50=0.34 μmol·L-1）的效果優(yōu)于陽性藥他克林（IC50=0.45 μmol·L-1）。結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS）對這些化合物在人字果屬植物中的分布及含量進行了測定[25]，發(fā)現(xiàn)了活性化合物在耳狀人字果中均有分布，在根中的含量要高于莖葉。另外，還對10 種人字果屬植物的提取物進行了大麻素受體1（CB1）和CB2 的活性篩選，結(jié)果表明，人字果屬樣品對大麻素受體具有一定的激動作用，對CB2 的激動活性明顯高于CB1，但大部分樣品的激動活性較弱。在所有的種中，三小葉人字果對CB2 的激動活性最強，這可能與其益智補神的傳統(tǒng)功效相關。

4 人字果屬藥用植物親緣學初探

從親緣關系上來看，人字果屬隸屬于唐松草亞科。在形態(tài)上，人字果屬與扁果草屬較為相似，分子系統(tǒng)發(fā)育則證實，人字果屬與扁果草屬和擬扁果草屬具有較近的親緣關系。在化學成分上，人字果屬和扁果草屬都含有芐基異喹啉生物堿和黃酮（醇）苷，具有一定的相似性[26]。不同的是，扁果草屬中富含雙芐基異喹啉生物堿，而人字果屬中以阿樸菲型和原小檗堿型生物堿為主，人字果屬中還含有氰類化合物和豐富的三萜皂苷類化合物，這2 類化合物目前還未從扁果草屬中分離得到。在人字果組中，三萜皂苷是縱肋人字果系和人字果系的差異化合物，且主要分布在縱肋人字果系的縱肋人字果中。在形態(tài)學特征的比較中，F(xiàn)u[9]認為，縱肋人字果具有2年生的習性和特化的種子（紡錘形，且具縱肋突起），是演化水平較高的種，進化程度較高的三萜皂苷的出現(xiàn)為分析縱肋人字果的演化水平和屬內(nèi)分類地位提供了化學依據(jù)。

從傳統(tǒng)功效上來看，人字果屬植物具有清熱解毒、消腫、健脾益胃、明目、驅(qū)風等作用，清熱解毒的功效可能與其普遍含有芐基異喹啉生物堿有關。耳狀人字果的全草和根莖可被用于治療母豬瘋（癲癇），三小葉人字果的全草具有益智補神的功效，這2 種植物可能具有神經(jīng)系統(tǒng)保護方面的藥理活性。本課題組發(fā)現(xiàn)人字果屬中的原小檗堿型芐基異喹啉化合物具有作為AchE抑制劑的潛力，在一定程度上證實了耳狀人字果具有神經(jīng)保護作用的傳統(tǒng)功效，這說明了藥用植物的傳統(tǒng)應用在尋找先導化合物和藥用資源開發(fā)方面的價值。該屬植物清熱解毒、消腫的功效可能與抗菌、抗病毒的藥理活性有關。在縱肋人字果中發(fā)現(xiàn)了豐富的三萜皂苷類化合物，有望通過對此類化學成分的深入挖掘（活性篩選和化合物定向分離），從中開發(fā)活性先導化合物。

人字果屬內(nèi)的裂瓣人字果、麻栗坡人字果和粉背葉人字果等種尚存在爭議，可通過分子生物學技術或化學分類學方法深入研究它們之間的屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關系。目前，僅從人字果屬植物中分離獲得16個化合物，雖然采用液質(zhì)聯(lián)用技術方法鑒定了120多個化合物，包括芐基異喹啉生物堿、黃酮、三萜皂苷、內(nèi)酯等，但臺灣人字果、鐵線蕨葉人字果和粉背葉人字果等植物尚沒有化學成分研究，該屬植物的化學成分仍需要進一步深入研究。人字果屬中有7 個種具有傳統(tǒng)藥用記載，但大部分未得到現(xiàn)代藥理活性研究證實。另外，人字果屬植物的許多種在我國僅分布于秦嶺以南的西南地區(qū)，生長環(huán)境特殊，樣品采集困難，資源相對匱乏，應當對該屬植物的資源保護給予更多關注。

5 結(jié)語與展望

我國藥用植物資源豐富，近幾十年來科研人員在資源調(diào)查、整理和科學研究中取得了長足的進展，為中醫(yī)藥傳承和創(chuàng)新發(fā)展提供了有力地支撐，并進一步認識到傳統(tǒng)藥用資源仍有深入挖掘的空間。人字果屬植物為東亞地區(qū)特有，主要分布于我國的毛茛科草本植物，具有多種傳統(tǒng)藥用記載。然而其藥用價值長期沒有引起重視和深入研究。目前，對該屬的研究主要集中于分類學和系統(tǒng)位置關系方面，但對化學成分和藥理活性的初步研究已顯示出該屬植物化學成分的豐富多樣性和活性潛力。

藥用植物親緣學是研究植物親緣關系、化學成分和功效活性（包括藥理活性）等間相關性的交叉學科，在多種藥用植物類群的整理和深入研究中發(fā)揮了重要作用。本文在對人字果屬植物相關研究整理總結(jié)的基礎上，對該屬的藥用親緣關系進行了初步探討，有助于更好地對該屬植物的全面認識和藥用價值挖掘，為該屬植物的深入研究和開發(fā)利用提供了參考。