牛蒡根提取物抗肺癌活性部位篩選

苗 航，張瑜倪，劉冬雪，郭素華，林珠燦

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

牛蒡根為菊科牛蒡?qū)僦参锱］颍ˋrctium lappa L）的根，又名東洋參，為藥食兩用性植物，其味辛、苦，性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、宣肺祛痰、利咽透疹之功，主治外感風(fēng)熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥［1］。 該植物在山東、江蘇、河南、福建、臺(tái)灣等地均有分布，尤其在福建省有豐富的生藥資源及良好的用藥基礎(chǔ)。 據(jù)記載，牛蒡根中主要含有氨基酸類、糖類、多酚類（咖啡酸、綠原酸等）、黃酮類、炔類和揮發(fā)油類等活性成分［2］。 現(xiàn)代藥理研究顯示：牛蒡根具有抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等活性［3］。 但是目前關(guān)于牛蒡根提取物抗腫瘤活性部位的研究尚未見報(bào)道，這極大地限制了牛蒡根藥用價(jià)值的深入開發(fā)與臨床應(yīng)用。 故本實(shí)驗(yàn)以IC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選牛蒡根抗腫瘤活性部位，并以肺癌A549 細(xì)胞構(gòu)建皮下移植瘤裸鼠模型，通過測(cè)定腫瘤體積、瘤體質(zhì)量等進(jìn)一步觀察牛蒡根活性部位抗肺癌的作用，以期為牛蒡根防治腫瘤的臨床應(yīng)用及產(chǎn)品研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肺癌A549 細(xì)胞均購(gòu)自漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，35 只雄性BALB／c 裸鼠，體質(zhì)量（20±2）g，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1 周后開始試驗(yàn)，合格證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 牛蒡根產(chǎn)自臺(tái)灣省臺(tái)南縣永康市（福建康力得力食品有限公司，批號(hào)：20190718），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室車蘇容老師鑒定為菊科植物牛蒡根制成的干燥茶絲。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Amresco 公司，批號(hào)：0793）；順鉑（ 上海源葉生物技術(shù)有限公司， 批號(hào)：B1210L79601）；石油醚（批號(hào)：F20150712）、正丁醇（批號(hào)：20150706）、三氯甲烷（批號(hào)：20170904）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱（瑞軒電子科技上海有限公司，型號(hào)：Galaxy 170R）；多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan 公司，型號(hào)：Infinite200 PRO）；－80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司，型號(hào)：HFU586）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：YXQ-LS-75SIII）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物 制備稱取牛蒡根茶絲250 g，按照料液比1∶6，加入1 500 mL 石油醚（沸點(diǎn)為30～60 ℃），浸泡過夜，60 ℃水浴加熱回流提取2 次，每次2 h；合并提取液，過濾，低溫減壓回收溶劑至干，得石油醚部位。 提取后所剩藥渣再加入乙酸乙酯溶液，制備方法同石油醚部位，得乙酸乙酯部位。 收集經(jīng)石油醚及乙酸乙酯提取后的藥渣，加入8 倍量的水，100 ℃煎煮提取2 次，每次90 min；合并煎煮液，減壓過濾后濃縮至原提取液體積的1／5，用玻璃棒邊攪拌邊緩慢加入95%乙醇，用酒精計(jì)測(cè)定含醇量達(dá)70%后保鮮膜封口，將其置于4 ℃冰箱靜置12 h；取出后以4 000 r／min 離心10 min，棄上清，將沉淀物放置60 ℃烘箱中干燥，即得含有多糖成分的粗提物；將所得粗提物加蒸餾水溶解制成濃度為50 mg／mL 粗提液，加入粗提液總量1／3 體積的sevage 溶液（三氯甲烷∶正丁醇＝4∶1）充分震蕩后用分液漏斗分離，共萃取8 次，上清液凍干后即為多糖。

2.2 肺癌A549 細(xì)胞體外增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配成適宜濃度的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)／mL 反復(fù)吹打均勻后，以100 μL／孔的體積沿96 孔板孔壁加入，將孔板置于37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 待各孔中細(xì)胞完全貼壁后給藥，設(shè)置對(duì)照組、順鉑組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、多糖組。 順鉑組濃度為1、5、10、20、40 μg／mL，石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、多糖組濃度為50、200、400、600、800 μg／mL，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，每孔150 μL，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入5 mg／mL MTT溶液10 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4 h，終止培養(yǎng)，加入100 μL／孔DMSO 溶液以溶解結(jié)晶紫晶體，在490 nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD 值。重復(fù)試驗(yàn)3 次，取其均值計(jì)算細(xì)胞抑制率，并使用SPSS 25.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2.2.1 牛蒡根各提取部位對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖抑制的作用 MTT 法檢測(cè)不同濃度的牛蒡根提取物在24、48、72 h 的作用時(shí)間下對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖抑制作用的影響。 由圖1 可知：石油醚部位對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。 石油醚部位濃度在0～600 μg／mL 時(shí)，對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的增殖抑制作用隨著時(shí)間和濃度的增加而逐步增強(qiáng)，具有時(shí)間和劑量依賴性；當(dāng)石油醚部位濃度大于600 μg／mL時(shí)，其抑制率趨于平緩甚至下降。 此外，當(dāng)石油醚部位濃度為600～800 μg／mL 時(shí)，其24、48、72 h 抑制率均大于80%。

圖1 不同濃度及牛蒡根提取部位對(duì)A549 細(xì)胞的抑制率比較

2.2.2 各組對(duì)肺癌A549 細(xì)胞不同作用時(shí)間點(diǎn)的IC50值比較 通過SPSS 25.0 軟件計(jì)算IC50值可知：牛蒡根各提取部位中僅石油醚部位對(duì)肺癌A549 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，陽性藥順鉑各時(shí)間點(diǎn)的IC50值均顯著低于石油醚部位。 結(jié)果見表1。

表1 4 組對(duì)肺癌A549 細(xì)胞不同作用時(shí)間點(diǎn)IC50 值比較 μg／mL

2.3 石油醚部位的初步毒性考察 將30 只昆明小鼠隨機(jī)分為6 組，每組5 只，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F 組，A 組為陰性對(duì)照組，每天灌胃蒸餾水；B、C、D、E、F 組分別以石油醚部位200、400、800、1 600、3 200 mg／kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥7 d。給藥結(jié)束后觀察小鼠的狀況與體質(zhì)量變化并記錄。

2.4 A549 肺癌移植瘤裸鼠模型建立及給藥 收集狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549 細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞母液，然后用PBS 稀釋成濃度為1.5×107個(gè)／mL 單細(xì)胞懸液，立刻置于冰上，備用。 用酒精棉球擦拭注射部位，吸取0.2 mL 密度均勻的A549 單細(xì)胞懸液緩慢接種在每只裸鼠的右腋皮下，每只裸鼠接種3×106個(gè)細(xì)胞。 將35 只裸鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、低劑量組和高劑量組，每組7 只，接種第2 天開始給藥。 陽性藥組每只以0.2 mL 腹腔注射3 mg／kg 順鉑；空白組、模型組以蒸餾水灌胃；低劑量組、高劑量組分別以牛蒡根石油醚部位400、1 600 mg／kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥15 d。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 記錄鼠體質(zhì)量和腫瘤體積 從給藥當(dāng)天算起，定期（隔天）稱量裸鼠體質(zhì)量并計(jì)算鼠體質(zhì)量變化。 在所有裸鼠腫瘤長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（A）和短徑（B），做好記錄并計(jì)算瘤體積。

2.5.2 記錄腫瘤質(zhì)量和臟器指數(shù) 給藥結(jié)束后，完整剝離腋窩皮下實(shí)體瘤，稱取腫瘤質(zhì)量，根據(jù)各組平均瘤質(zhì)量（M）計(jì)算抑瘤率。 同時(shí)摘取脾臟、肝臟、腎臟和肺臟并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 石油醚部位初步毒性考察 由表2 和表3 中結(jié)果可知：當(dāng)給藥量為1 600 mg／kg 時(shí)，小鼠出現(xiàn)干嘔、撓鼻等反應(yīng)，但很快恢復(fù)；當(dāng)給藥量增至3 200 mg／kg時(shí)，小鼠出現(xiàn)炸毛、雙腳無力、流淚等不良反應(yīng)，且恢復(fù)時(shí)間增至5 h，期間無小鼠死亡。石油醚部位各濃度組和蒸餾水組體質(zhì)量均呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，其體質(zhì)量變化與蒸餾水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明石油醚部位對(duì)小鼠無明顯毒性。 考慮到牛蒡根為藥食同源性植物，為確保其藥效，我們選擇小鼠反應(yīng)不太明顯且很快恢復(fù)狀態(tài)的劑量1 600 mg／kg作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高濃度給藥劑量，400 mg／kg 作為低濃度給藥劑量。

表2 給藥后小鼠一般狀況比較

表3 不同給藥劑量小鼠體質(zhì)量變化比較（±s）g

表3 不同給藥劑量小鼠體質(zhì)量變化比較（±s）g

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組n555555給藥劑量／（mg／kg）0 200 400 800 1 600 3 200初始體質(zhì)量25.0±1.58 25.8±0.84 26.6±0.89 27.0±1.00 26.2±1.10 26.2±1.30 7 d 后體質(zhì)量27.0±1.87 28.0±1.41 28.4±1.14 28.0±2.92 27.8±2.28 27.4±2.70體質(zhì)量變化2.0±0.71 2.2±1.30 1.8±1.30 1.0±2.00 1.6±1.34 1.2±2.28

3.2 石油醚部位對(duì)移植瘤裸鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響 裸鼠在給藥7 d 后均長(zhǎng)出瘤體，實(shí)驗(yàn)期間移植瘤裸鼠未發(fā)現(xiàn)死亡。 由表4 可知：正常組、模型組、低劑量和高劑量組裸鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)；與正常組和模型組比較，陽性藥組裸鼠體質(zhì)量變化和脾臟指數(shù)明顯降低（P＜0.01），而其余實(shí)驗(yàn)組差異不明顯（P 均＞0.05），這可能與陽性藥對(duì)小鼠有較強(qiáng)毒副作用有關(guān)。

表4 各組裸鼠體質(zhì)量變化及脾臟指數(shù)比較（±s）mg／g

表4 各組裸鼠體質(zhì)量變化及脾臟指數(shù)比較（±s）mg／g

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n77777體質(zhì)量變化／g 1.29±1.89 2.14±1.07 1.86±0.69 1.57±0.98-2.43±1.131）2）脾臟指數(shù)4.29±1.20 4.92±1.13 4.33±1.12 4.04±0.74 2.84±0.311）2）肝臟指數(shù)43.89±7.35 43.58±3.20 44.52±4.38 40.45±4.49 45.20±3.96腎臟指數(shù)12.16±1.05 11.52±0.61 10.90±0.54 11.04±0.57 11.70±2.26肺臟指數(shù)6.64±0.36 6.67±0.47 6.52±0.99 6.35±0.43 6.05±0.84

3.3 石油醚部位對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 由表5 可知：模型組瘤體積生長(zhǎng)迅速，在后面幾天出現(xiàn)膨脹性增長(zhǎng)；陽性藥組、低劑量和高劑量組移植瘤體積增長(zhǎng)速度與模型組比較明顯減緩，其中陽性藥組增長(zhǎng)速度最慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 由

表5 各組裸鼠瘤體積比較（±s）mm3

表5 各組裸鼠瘤體積比較（±s）mm3

注：與模型組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01。

組別模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n7777第7 天108.29±43.12 86.43±22.96 71.71±31.271）62.29±17.722）第9 天234.55±47.96 170.71±21.642）105.29±39.172）77.43±26.722）第11 天361.86±101.35 264.57±19.59 197.29±31.551）118.71±23.632）第13 天507.00±48.01 338.57±70.84 269.14±38.141）151.57±36.552）第15 天782.86±112.14 553.43±92.642）375.86±45.382）231.14±59.182）

圖2 各組對(duì)移植瘤生長(zhǎng)影響比較

表6 各組瘤重及抑瘤率比較（±s）

表6 各組瘤重及抑瘤率比較（±s）

組別模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n7777瘤重／g 1.42±0.31 1.10±0.13 0.74±1.20 0.42±0.19抑瘤率／%—22.65 48.03 70.43

4 討 論

腫瘤的基本特征是細(xì)胞的無限增殖，而許多中藥可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。肺癌是臨床上常見的呼吸道惡性腫瘤，其發(fā)病率隨著現(xiàn)代環(huán)境和生活方式的變化而增加，是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，其五年生存率低至18%［5-6］。 MTT法是分析細(xì)胞活性和檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的常用方法［7-8］。目前已有牛蒡根提取物對(duì)人白血病、腎癌、乳腺癌、胃癌細(xì)胞及小鼠肝癌、S180 腹水瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用研究，但未見其對(duì)人結(jié)腸癌、肺癌細(xì)胞的體外增殖抑制作用以及牛蒡根成分活性研究。 同時(shí)，牛蒡根歸肺、胃經(jīng)，因此，挑選肺癌A549 細(xì)胞進(jìn)行體外活性篩選，以期得到抗腫瘤活性部位。 MTT體外結(jié)果顯示：石油醚部位對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的增殖有較明顯的抑制作用，而乙酸乙酯和多糖部位則無明顯影響，說明牛蒡根抗腫瘤的活性部位可能是其石油醚部位。 體內(nèi)A549 肺癌小鼠移植瘤結(jié)果顯示：石油醚給藥組裸鼠體質(zhì)量及各臟器指數(shù)無顯著變化，但能明顯抑制瘤體體積的增長(zhǎng)和瘤體質(zhì)量，且其抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)，而順鉑組裸鼠體質(zhì)量和脾臟指數(shù)則出現(xiàn)明顯下降。 這說明石油醚部位能抑制A549 移植瘤的生長(zhǎng)，具有濃度依賴性，且毒副作用較小。

石油醚部位主要含揮發(fā)油等揮發(fā)性成分及一些小分子成分［9］。 研究發(fā)現(xiàn)中藥揮發(fā)油能顯著地抑制肺癌、結(jié)腸癌、肝癌及胃癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)［10］，由此可見，牛蒡根發(fā)揮抗腫瘤作用可能與其所含的揮發(fā)油成分有關(guān)。