基于HPLC 指紋圖譜與多元化統(tǒng)計法的黃芩質(zhì)量評價研究

連赟芳

（1.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省片仔癀天然醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室，福建 漳州 363000）

黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，是中醫(yī)臨床常用清熱藥之一［1］。 黃芩具有多種化學成分，主要為黃酮類、甾體類、揮發(fā)油及多種微量元素［2］。 現(xiàn)代研究表明：黃芩中黃酮類的成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素具有抗癌、抗氧化等藥理作用［3-6］。 中藥指紋圖譜能全面反映中藥所含內(nèi)在化學成分的種類與數(shù)量，進而有效表征中藥的質(zhì)量及穩(wěn)定性［7］，同時結合多元化統(tǒng)計法進行數(shù)據(jù)分析，已成為國際公認的控制中藥質(zhì)量的有效手段之一［8］。 本研究通過收集30批黃芩樣品，建立HPLC 指紋圖譜，同時結合相似度評價、聚類分析、主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），進行多產(chǎn)地、多批次黃芩的質(zhì)量評價，為黃芩中藥資源、利用及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Arc 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Waters 2998 光電二極管陣列檢測器；Empower 3（2998）色譜工作站；METTLERAE XS-205DR 十萬分之一電子天平、METTLERAE XPE504 萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ 500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品黃芩苷（批號：110715-201821，純度：95.4%）、黃芩素（批號：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素（批號：111514-201706，供鑒別使用）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（美國Merck 公司）；水為超純水；磷酸為分析純。

黃芩樣品來源見表1。

表1 黃芩樣品來源

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品各約10.0 mg，分別置100 mL 量瓶，加70%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg／mL 黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品儲備液。 分別精密量取黃芩苷對照品儲備液、黃芩素對照品儲備液、漢黃芩素對照品儲備液各5 mL至100 mL 量瓶，加70%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取黃芩樣品粉末約0.3 g，精密稱定，置250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 采用Waters Arc高效液相色譜儀，色譜柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B）。 梯度洗脫程序：0～10 min，35%～45%（A）；10～15 min，45%～70%（A）；15～40 min，70%（A）；40～45 min，70%～35%（A）；柱溫為20 ℃；流速為1.0 mL／min；檢測波長為280 nm。 分別精密量取混合對照品溶液、供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.4 特征圖譜方法學考察

2.4.1 色譜柱及參照物峰的選擇及專屬性考察 分別精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄60 min 色譜圖，考察色譜柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18、PX-C18、Waters SunFireTM C18、Ultimate XB-C18 及Thermo BDS HYPERSIL C18 5 個廠家的色譜柱，分析測定同一供試品。 實驗結果表明：PX-C18、Ultimate XB-C18 分 析 柱 保 留 時 間 延后，Thermo BDS HYPERSIL C18 柱的分離效果不夠穩(wěn)定，故選擇GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色譜柱。

采用GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），記錄60 min 色譜圖，黃芩苷色譜峰在供試品色譜圖上保留時間適中，且黃芩苷又是黃芩含量測定指標性成分，色譜峰面積最大，與相鄰峰分離良好，故選擇黃芩苷為參照物峰（S），按黃芩苷峰計理論塔板數(shù)應＞2 500。

分別考察混合對照品溶液色譜圖、供試品溶液運行60 min 及120 min 色譜圖，結果顯示各組分在60 min 內(nèi)均流出色譜柱，故確定樣品的運行時間為60 min。 結果見圖1。

圖1 混合對照品溶液和供試品溶液高效液相色譜圖

2.4.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，計算各共有峰的相對保留時間（RRT）和峰面積比值（PAR）。 實驗結果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.1%，符合規(guī)定。

2.4.3 重復性試驗 分別取同一批樣品6 份（編號S13），按“2.2”和“2.3”項下同法操作，進樣，計算各共有峰的RRT 和PAR。 實驗結果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.2%，符合規(guī)定。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 分別取同一供試品溶液，室溫下保存，分別于0、2、4、6、8、12、14、16 h 處測定，計算各共有峰的RRT 和PAR。 實驗結果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.2%，PAR 的RSD＜1.2%，符合規(guī)定。

2.5 30 批黃芩指紋圖譜的建立 按照“2.2”和“2.3”項下同法操作，將30 批黃芩樣品HPLC 數(shù)據(jù)以AIA 格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012 版）”，以編號S13 樣品作為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.5，經(jīng)過多點校正-峰匹配，生成30 批黃芩樣品指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜，見圖2。

圖2 30 批黃芩樣品指紋圖譜的疊加圖及對照指紋圖譜

2.6 相似度評價 分析評價30 批黃芩樣品指紋圖譜各批間以及各批與對照指紋圖譜的相似度。 實驗結果表明：30 批黃芩樣品的相似度均大于0.990，符合指紋圖譜建立要求（0.900～1.000）。 主要共有峰面積比值范圍為1∶2∶3∶4∶5∶6∶7∶8∶9∶10∶11＝（0.005 8～0.029 8）∶（0.025 5～0.037 7）∶（0.018 1～0.034 1）∶（0.019 8～0.056 0）∶（1.000 0）∶（0.057 7～0.089 3）∶（0.058 4～0.096 7）∶（0.188 0～0.236 4）∶（0.029 4～0.247 7）∶（0.012 5～0.103 4）∶（0.003 1～0.038 5）。結果見表2。

表2 30 批黃芩樣品相似度結果

2.7 共有峰的分析及歸屬 分析30 批黃芩樣品指紋圖譜，確定1～11 號為共有峰，共有峰保留時間（峰號）分別約為8.998 min（1）、13.736 min（2）、15.468 min（3）、18.146 min（4）、18.562 min（5）、19.584 min（6）、20.045 min（7）、20.418 min（8）、23.124 min（9）、28.395 min（10）、30.795 min（11）。其中，5 號峰為黃芩苷，9 號峰為黃芩素，10 號峰為漢黃芩素；相對保留時間（峰號）分別約為0.485（1）、0.740（2）、0.833（3）、0.977（4）、1.000（5）、1.055（6）、1.080（7）、1.100（8）、1.244（9）、1.527（10），1.656（11），其中5 號峰為參照峰S 峰。 以S 峰的保留時間和峰面積為基準，計算各共有峰的RRT 和PAR。

比較參照物色譜圖、各批供試品色譜圖，確定黃芩供試品色譜圖的主要物質(zhì)群特征峰及其歸屬，指紋圖譜中5、9 和10 號峰為黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。 實驗結果表明：共有峰總面積占總峰面積97.36%，非共有峰面積占總峰面積2.64%，均符合指紋圖譜規(guī)定。 結果見表3。

表3 黃芩樣品指紋圖譜成分峰歸屬分析

2.8 聚類分析 運用Minitab 20 軟件，以30 批黃芩樣品指紋圖譜中11 個共有峰的峰面積為變量，選擇最長距離聯(lián)結法，距離度量為Euclidean，進行觀測值聚類。30 批黃芩樣品被聚為4 類。 樣品編號S24 聚為一類，樣品編號S1、S4～S5、S8～S9、S14、S26 聚為一類，樣品編號S2、S12、S28～S30、S23 為一類，其余樣品編號聚為一類。 說明不同產(chǎn)地的黃芩藥材存在一定的差異。

2.9 基于PCA 的差異模型建立 采用Minitab 20 軟件，以11 個共有峰峰面積為變量，對30 批黃芩樣品進行PCA，選擇相關矩陣類型，計算主成分特征值及累計貢獻率。 結果表明特征值＞1 的主成分有3 個，且累計貢獻率為85.9%，建立的指紋圖譜基本能客觀反映30 批黃芩的樣本信息。

2.10 基于OPLS－DA 模型建立 以30 批黃芩樣品HPLC 指紋圖譜的11 個共有峰峰面積為變量，導入SIMCA-P 14.1 分析軟件，啟動OPLS-DA 分析程序，VIP 值＞1 的化合物對模型的貢獻度較大。 經(jīng)分析篩選不同批次黃芩樣品質(zhì)量差異的5 個峰，其影響程度依次為10 號峰（漢黃芩素）＞9 號峰（黃芩素）＞2 號峰＞4 號峰＞11 號峰，上述5 個峰可能是導致不同批次樣品之間產(chǎn)生差異的主要原因。

3 討 論

3.1 前期供試品溶液制備過程中，比較《中華人民共和國藥典》（2020 年版）黃芩藥材含量測定項供試品溶液制備，發(fā)現(xiàn)兩種制備方法對化學成分的提取影響不大，考慮操作方便，故選擇70%乙醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.2 實驗分別比較了不同比例的流動相，如甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等，結果甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫各色譜峰達到完全分離、基線平穩(wěn)、峰形穩(wěn)定，故選擇甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫為流動相。

3.3 通過相似度評價獲得30 批黃芩樣品指紋圖譜相似度均大于0.990，表明該30 批黃芩樣品具有相似的化學成分，存在較高一致性；通過聚類分析30 批黃芩樣品聚為4 類，表明不同產(chǎn)地黃芩藥材存在一定的差異；PCA 結果顯示特征值＞1 的3 個主成分能基本反映30 批樣品信息；OPLS-DA 結果顯示影響黃芩質(zhì)量的因素，主要為黃芩素、漢黃芩素、2 號峰、4 號峰和11 號峰，不包括《中華人民共和國藥典》規(guī)定含量測定成分黃芩苷，說明不同批次、不同產(chǎn)地黃芩所含黃芩苷含量差異不大，提示采用單一成分定量無法真實評判黃芩質(zhì)量優(yōu)劣。

3.4 本研究以30 批黃芩樣品作為研究對象，建立HPLC 指紋圖譜，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗中RRT 和PAR 的RSD 小于3.0%，均符合要求。 同時結合相似度評價、PCA、聚類分析、OPLS-DA 綜合評價多批次黃芩樣品的整體質(zhì)量，為中醫(yī)臨床用藥選擇、黃芩質(zhì)量標準提高及黃芩相關制劑質(zhì)量研究提供依據(jù)。