1株卵形鯧鲹病原菌的分離、鑒定及其藥敏試驗

丁澤昊，趙子晨，李桂華，郭偉良，3，張冬冬，周永燦

（1.海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223）

卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）俗稱短鰭鯧、金鯧等，屬于鲹科（Carangidae），鯧鲹屬（Trachinotus），為中上層洄游暖水性海水魚類.其肉無刺，并且肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，生長速度快，海南從20世紀(jì)90年代初就已經(jīng)開展了卵形鯧鲹海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖［1］，現(xiàn)在卵形鯧鲹已成為海南、廣東、廣西和福建等地區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一，并且在海南已發(fā)展為當(dāng)前單一養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水養(yǎng)殖魚類［2］，據(jù)統(tǒng)計，2016年海南省金鯧魚的產(chǎn)量達(dá)到5萬t，產(chǎn)值達(dá)10億元以上.但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度的不斷提高以及近海養(yǎng)殖環(huán)境的衰退等諸多原因［3］，卵形鯧鲹的病害日趨嚴(yán)重［2-5］.刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）病、諾卡氏菌（Nocardia seriolae）病、美人魚發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）病和鏈球菌（Streptococcussp.）病等都對其養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的危害.海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）屬于鏈球菌科（Streptococcidae），鏈球菌屬（Streptococcus），它是一種常見的世界性分布的條件致病病原［6-7］，其主要感染溫水魚類.其中，卵形鯧鲹即為海豚鏈球菌易感魚類，廣東和廣西等地均有卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌的報道［8-11］.海豚鏈球菌可通過魚體受傷部位以及消化道進(jìn)入其血液循環(huán)系統(tǒng)，亦可突破其血腦屏障進(jìn)入腦部，破壞腦神經(jīng)，從而導(dǎo)致腦部充血或出血，致使宿主出現(xiàn)異常的螺旋狀旋轉(zhuǎn)游泳，在水面做頭向上或者尾向上的轉(zhuǎn)圈游動等癥狀；此外，海豚鏈球菌還可以通過血液循環(huán)破壞卵形鯧鲹的肝、腎、脾等器官，引發(fā)其全身性出血，并伴隨腸道積水而引起的腹水癥狀［12-16］.2020年7月，在海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)卵形鯧鲹的養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)出現(xiàn)了疑似海豚鏈球菌感染癥狀的疾病，為弄清卵形鯧鲹的致病原因，本研究采集了患病卵形鯧鲹的魚樣本，并對其進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗，旨在為該疾病的防控提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1實驗材料患病卵形鯧鲹于2020年7月采集自海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)的卵形鯧鲹養(yǎng)殖網(wǎng)箱，魚體重為（65±15）g；試驗用魚購于海南臨高縣某卵形鯧鲹養(yǎng)殖場，體重為（30±10）g，暫養(yǎng)于循環(huán)水族箱（300 L）28d，養(yǎng)殖水溫、pH、鹽度和透明度分別維持在（30.0±1.0）°C、（8.1±0.3）、（30±0.4）和0.75 m，持續(xù)充氧，每天換1/3體積的水.

1.2病原的分離與純化檢查瀕臨死亡的卵形鯧鲹的外部癥狀并進(jìn)行拍照和記錄，用100μL/L丁香酚將魚麻醉后，用酒精（φ=75%）棉球擦拭病魚體表，于超凈工作臺打開病魚腹部，檢查病魚的肝臟、脾臟和腎臟，從中取樣并分別接種于硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基（北京路橋生物有限公司）和腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基（青島日水生物有限公司）上，于30°C倒置培養(yǎng)48 h，觀察各分離菌株的菌落形態(tài)并計數(shù)，挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落，進(jìn)一步劃線于新配制的以上兩種瓊脂培養(yǎng)基，30°C純化培養(yǎng)48 h，于4°C保存?zhèn)溆?

1.3分離菌的人工感染試驗將分離的優(yōu)勢菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)36 h，接著用φ=0.7%的無菌生理鹽水沖洗菌苔，制成菌懸液，然后以麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液稠密度至1×109CFU/mL.將40尾暫養(yǎng)28 d的卵形鯧鲹［體重為（60±10）g］隨機(jī)分至4個水族箱（300 L），每個水族箱10尾魚，每2個水族箱一組，分別為對照組和人工感染組，人工感染組的每尾魚腹腔注射0.1 mL菌懸液，對照組的魚則注射相同體積的無菌生理鹽水.實驗期間保持24 h持續(xù)充氧，每日觀察魚的癥狀與死亡數(shù)量，連續(xù)觀察72 h，并將發(fā)病魚按1.2的方法進(jìn)行病原菌分離.

1.4病原菌對卵形鯧鲹半致死濃度（LC50）的測定將1.3中獲得的致病菌株用φ=0.7%的無菌生理鹽水制成菌懸液，用麥?zhǔn)媳葷岱y其稠密度，然后用φ=0.7%的無菌生理鹽水分別梯度稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/mL，制成菌懸液樣品，接著將100尾暫養(yǎng)14 d的卵形鯧鲹隨機(jī)分至10個水族箱（300 L），每2個水族箱為一組，共五組.每尾魚以腹腔注射的方式注射0.1 mL以上制備的不同稠密度的菌懸液，對照組則注射無菌生理鹽水.每日記錄魚的癥狀與死亡數(shù)量，連續(xù)觀察14 d.

1.5病原菌的鑒定

1.5.1病原菌菌落的形態(tài)觀察將1.3中所分離的病原菌劃線于羊血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上，于30°C倒置培養(yǎng)36 h，觀察其菌落形態(tài)和溶血圈.

1.5.216SrRNA基因序列分析取對數(shù)生長期的新鮮菌液，利用細(xì)菌基因組試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取所分離的病原菌DNA.以細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物（上游引物：5′?AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG?3′；下游引物：5′?TACGGCTACCTTGTTACGAC?3′）作為引物，以1μL DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：94°C 3 min；94°C 3 min，55°C 1 min，72°C 1 min，30個循環(huán)；72°C 5 min.PCR產(chǎn)物在ω=1%的瓊脂糖凝膠于180 V電泳15 min，用回收試劑盒（Biomed公司）切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物送至華大基因公司測序.將測序所得序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析，然后利用Mega 7.0.26軟件對與該序列相關(guān)性較高的核酸序列進(jìn)行序列比對，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

1.5.3生理生化鑒定參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定學(xué)手冊》（第8版）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定.

1.6藥敏實驗采用K?B紙片瓊脂擴(kuò)散法對所分離的病原菌進(jìn)行30種抗生素（杭州微生物試劑有限公司）的藥敏試驗.對于經(jīng)30°C純化培養(yǎng)36 h的病原菌菌液，用比濁法和稀釋涂布平板法測定其稠密度，并使菌液稠密度為1×107CFU/mL，在30°C孵育24 h后，測量細(xì)菌在BHI平板上的抑菌圈直徑，以確定其對藥物的敏感情況：敏感性（S）、中等敏感性（I）和耐藥性（R）.

2 結(jié) 果

2.1自然發(fā)病的卵形鯧鲹的臨床癥狀患病卵形鯧鲹的主要癥狀為：體色變黑，鰭基、肛門或身軀出血（圖1-A、圖1-B）；并且鰓部呈現(xiàn)出明顯的出血和充血（圖1-C）.解剖后的器官病變包括：脾臟和肝臟腫大并有出血；膽囊腫大，腹腔積水（圖1-D、圖1-E）；腸道內(nèi)有積水或黃色粘液（圖1-E）.

圖1 自然發(fā)病的卵形鯧鲹的臨床癥狀

2.2病原的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察利用BHI瓊脂平板對病魚進(jìn)行病原分離，結(jié)果顯示：病魚腦部、肝臟、腎臟等部分均可分離出1株優(yōu)勢菌，優(yōu)勢菌占所在培養(yǎng)基平板上細(xì)菌總量的95%以上.菌落呈乳白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊、約0.6 mm（圖2-A）；該優(yōu)勢菌在血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上于30°C培養(yǎng)18 h后，其菌落呈乳白色，菌落周圍為透明的β溶血圈（圖2-B）.

圖2 病原菌的菌落形態(tài)

2.3人工感染的試驗結(jié)果人工感染的試驗結(jié)果顯示，將0.1 mL分離到的優(yōu)勢菌菌懸液（菌液稠密度為1×109CFU/mL）以腹腔注射的方式注射到卵形鯧鲹后，人工感染組的卵形鯧鲹于72 h內(nèi)全部死亡，而對照組則無卵形鯧鲹死亡.病魚主要呈現(xiàn)出缺氧、體色發(fā)黑、鰭條基部出血等癥狀，解剖后發(fā)現(xiàn)其腹腔有積液，其癥狀與自然發(fā)病的癥狀基本一致，從瀕死魚體中所分離的菌株與初次分離的菌株在形態(tài)和特征上是一致的.

2.4所分離的病原菌對卵形鯧鲹的LC50利用腹腔注射的方式感染卵形鯧鲹，其死亡主要發(fā)生在前4 d內(nèi)，對照組則未出現(xiàn)死亡，其實驗結(jié)果見圖3，采用寇氏法［17］計算出病原菌的半致死濃度為6.863×105CFU/mL.

圖3 海豚鏈球菌感染健康卵形鯧鲹的試驗結(jié)果

2.5病原菌的鑒定

2.5.1病原菌16SrRNA基因序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析將所分離到的菌株的16SrRNA基因序列與NCBI網(wǎng)站已有序列進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示，所分離到的菌株與海豚鏈球菌的同源性最高，故選取同源性高的鏈球菌屬的16SrRNA序列，利用Mega 7.0.26軟件進(jìn)行序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖4），結(jié)果顯示，所分離到的卵形鯧鲹致病菌株與海豚鏈球菌聚為一支，同源性最高為98%；同時，結(jié)合生理生化特性將所分離到的病原菌株判定為海豚鏈球菌.

圖4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5.2生理生化特性用細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行生理生化鑒定，其結(jié)果見表1，分離菌的生理生化特征與海豚鏈球菌的生化特性基本吻合.

表1 試驗菌株的生化反應(yīng)分析

2.6采用K?B紙片瓊脂擴(kuò)散法的藥敏試驗對所分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗，測量其抑菌圈大小，以產(chǎn)品說明書判斷病原菌對各種藥物的敏感性.實驗結(jié)果如表2所示，試驗菌株對青霉素類，如羧芐西林、苯唑西林、哌拉西林；頭孢類，如頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮；氨基糖苷類，如丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、新霉素；四環(huán)素類，如四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素、麥迪霉素等25種藥品高度敏感；對氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、多粘菌素B則中度敏感；僅對青霉素耐藥.

表2 菌株對藥物的敏感性

3 討 論

本研究對2020年7月在海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)卵形鯧鲹養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)的細(xì)菌性疾病進(jìn)行了病原菌的分離，通過人工感染試驗觀察到，實驗魚的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病個體的癥狀基本一致，同時也證實了所分離的優(yōu)勢菌為該病的主要病原菌.其主要發(fā)病癥狀符合海豚鏈球菌病的發(fā)病癥狀［18］，通過對所分離菌株的形態(tài)學(xué)特征的觀察和生理生化特性的分析，初步鑒定其病原菌為海豚鏈球菌；在進(jìn)一步采用16SrRNA基因序列進(jìn)行鑒定后，確定其與S.iniae（ATCC29178）的同源性最高，故該致病菌亦被初步鑒定為海豚鏈球菌，因此對于本次卵形鯧鲹所爆發(fā)的疾病，其主要病原可能為海豚鏈球菌.1976年，陸英杰等從患皮膚膿腫的亞馬遜淡水海豚中首次分離出海豚鏈球菌，此后在養(yǎng)殖虹鱒中發(fā)現(xiàn)鏈球菌?。?9］，再以后鏈球菌感染魚體的情況呈全球性分布.近年來，在我國不同養(yǎng)殖區(qū)域相繼有關(guān)于海豚鏈球菌感染魚類并造成嚴(yán)重?fù)p失的報道［19-22］.陸英杰等［19］報道了在廣州佛山某羅非魚魚場爆發(fā)海豚鏈球菌病的病例；鄭李平［20］等報道了在四川彭州養(yǎng)殖鱘魚上發(fā)生的以神經(jīng)和出血癥狀為臨床特征的病魚，其體內(nèi)分離到的病原菌為海豚鏈球菌；楊移斌［21］等報道了福建漳州地區(qū)養(yǎng)殖黃顙魚上出現(xiàn)海豚鏈球菌病的癥狀.本研究也發(fā)現(xiàn)在海南省臨高縣橋頭鎮(zhèn)的養(yǎng)殖基地，卵形鯧鲹的體表及其重要組織器官亦出現(xiàn)符合海豚鏈球菌感染魚類的癥狀［18］.由此表明，海豚鏈球菌對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的危害日趨嚴(yán)重，應(yīng)給予高度關(guān)注.據(jù)文獻(xiàn)報道，在海豚鏈球菌感染的不同種類宿主中，其主要癥狀具有一定的差異［23］.在感染哺乳動物時宿主主要呈現(xiàn)蜂窩組織炎、腦膜炎及皮下膿腫等，而在魚類中宿主主要呈現(xiàn)眼球突出、全身性敗血及腦膜炎等癥狀［24］.此外，不同水生動物（宿主）的發(fā)病表現(xiàn)也有所不同，如在海豚上其表現(xiàn)為皮膚膿腫［9］；鱘魚則主要表現(xiàn)為全身性多組織和器官變性、壞死和出血等［20］；羅非魚卻主要表現(xiàn)為眼球突出或單邊混濁發(fā)白、眼眶充血和肛門紅腫等，且在解剖病魚后可見其膽汁稀薄和色淺［19］.本研究還發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌后其主要癥狀為體色變黑、鰭基和肛門出血，并且鰓部呈現(xiàn)出明顯的出血和充血；解剖后還可發(fā)現(xiàn)，其脾臟和肝臟腫大并有出血.這是與魚的種屬特異性還是與病原菌的生物學(xué)特性有關(guān)還有待進(jìn)一步的研究.

本研究中的藥敏實驗結(jié)果顯示，自卵形鯧鲹分離出的海豚鏈球菌對大部分四環(huán)素類、頭孢類和氨基糖苷類等藥物呈高度敏感，但對青霉素有耐藥性；武沛文等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，從湛江市太平鎮(zhèn)網(wǎng)箱養(yǎng)殖場的卵形鯧鲹魚體中分離到的海豚鏈球菌對四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物等17種試驗藥物敏感，但也對青霉素有耐藥性，這與本研究的結(jié)果相似.這很可能是水產(chǎn)養(yǎng)殖場長期使用青霉素而引起的［25-26］.因此，建議采用對四環(huán)素類、頭孢類和氨基糖苷類等敏感的藥物來進(jìn)行防治，但在使用過程中要避免反復(fù)加大量地使用單一抗生素，以避免病原菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象；同時應(yīng)鼓勵開發(fā)綠色的和安全的防治手段.目前，國內(nèi)外已有學(xué)者開展了有關(guān)海豚鏈球菌疫苗的研究［27-30］，如袁國尚等［31］的研究表明，九味羌活湯和桑菊飲這2種復(fù)方中草藥對鱘魚海豚鏈球菌具有較好的抑菌和殺菌效果；姚麗等［32］的研究也證實，黃連、黃芩、連翹、丁香和秦皮對海豚鏈球菌均具有較好的抑菌和殺菌功效.但是，目前對中草藥的作用機(jī)理尚未弄清，還有待做進(jìn)一步的研究和開發(fā)，唯有如此才能更好地控制海豚鏈球菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的影響.