液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對原發(fā)性醛固酮增多癥的診斷價值

程子韻， 陸志強

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200032

原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism，PA)是已知的繼發(fā)性高血壓中的最常見病因，在1、2、3級高血壓患者中的患病率分別為1.99%、8.02%和13.2%，而在難治性高血壓患者中高達17%～23%[1-3]。PA的診斷主要分為疾病篩查、確診試驗及分型3個步驟，對于篩查試驗陽性的患者需進一步行確診試驗來明確診斷。

目前常用于PA篩查和確診的檢測方法是以免疫技術(shù)為基礎(chǔ)的放射免疫法或化學(xué)發(fā)光法，但免疫法準(zhǔn)確性差、存在交叉干擾。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectro-metry，LC-MS/MS)具有靈敏度高、特異度高等優(yōu)點，正逐漸應(yīng)用于臨床，但其在PA篩查和確診中尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。我國指南目前推薦的生理鹽水抑制試驗(saline infusion test，SIT)診斷標(biāo)準(zhǔn)與國外一致，而卡托普利試驗(captopril test，CCT)推薦的診斷指標(biāo)與美國指南存在差異，上述結(jié)論均基于免疫法檢測結(jié)果推導(dǎo)而出[4-5]。本研究旨在探討LC-MS/MS測定下SIT和CCT對PA的診斷價值及最佳診斷截斷值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2018年2月至2019年2月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科收治入院的高血壓患者127例，年齡18～80歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)持續(xù)性高血壓(3次非同日測定血壓>150/100 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、難治性高血壓(聯(lián)合使用包括利尿劑在內(nèi)的3種降壓藥物，血壓大于140/90 mmHg；或聯(lián)合使用4種及以上降壓藥物，血壓<140/90 mmHg)；(2)高血壓合并自發(fā)性或利尿劑所致低鉀血癥；(3)高血壓合并腎上腺意外瘤；(4)具有早發(fā)性高血壓家族史或早發(fā)(<40歲)腦血管意外家族史；(5)患高血壓且一級親屬中存在PA家族史患者；(6)高血壓合并阻塞性呼吸睡眠暫停。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他繼發(fā)性高血壓病因患者，如腎性高血壓、腎動脈狹窄、嗜鉻細胞瘤、庫欣綜合征等；(2)慢性腎功能不全患者(估計腎小球濾過率<70 mL·min-1·1.72 m-2)；(3)嚴(yán)重心肺疾病患者(呼吸衰竭、心功能不全3級以上)；(4)肝功能不全、肝衰竭患者(肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高超過正常上限2倍)；(5)妊娠或目前正在應(yīng)用性激素、糖皮質(zhì)激素治療患者。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2010-70)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測前準(zhǔn)備 檢測前停用對激素檢測結(jié)果存在影響的藥物，包括利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑和甘草制劑。其中利尿劑及甘草制劑檢查前停用4周，其余藥物停用2周。

1.3 激素檢測方法 以核素氘為內(nèi)標(biāo)，以甲醇和水作為流動相，采用CORTEX C18色譜柱進行分離，采用Xevo TQS ACQUITY UPLC System儀器(Waters公司，美國)檢測血漿醛固酮濃度(plasma aldosterone concentration，PAC)。以arginine13C15N為內(nèi)標(biāo)，甲醇水溶液和甲酸甲醇溶液作為流動相，采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱進行分離，采用QTRAP○R6500(SCIEX公司，美國)儀器檢測腎素活性(plasma renin activity，PRA)。PAC的檢測線性范圍為25～2 000 pg/mL，定量檢出下限為12.5 pg/mL，批內(nèi)和批間不精密度的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)分別為<6%和小于10%。建立的PAC生物參考區(qū)間為21～211.6 pg/mL(立位)。PRA的檢測線性范圍為0.028～10.000 ng·mL-1·h-1，定量檢出下限為0.028 ng·mL-1·h-1，批內(nèi)和批間不精密度的CV均小于15%。建立的PRA生物參考區(qū)間為0.25～5.12 ng·mL-1·h-1(立位)。2種方法通過性能驗證，能有效應(yīng)用于臨床。

1.4 其他相關(guān)檢查 于6∶00采集患者空腹靜脈血，檢測肝腎功能、電解質(zhì)、空腹血糖、血脂等指標(biāo)。

1.5 CCT和SIT方法 (1)CCT：患者于8∶00口服卡托普利25 mg，服藥前靜臥30 min，分別于服藥前0 min、服藥后1 h、服藥后2 h，采用EDTA抗凝管抽取靜脈血測PAC和血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)水平。在整個試驗過程中患者保持坐位或平臥位。(2)SIT：試驗于8∶00至9∶30間開始，試驗前30 min及試驗期間患者均保持平臥位，于4 h內(nèi)連續(xù)靜脈滴注0.9%生理鹽水2 000 mL。于試驗前0 min和生理鹽水滴注4 h后，采用EDTA抗凝管抽取靜脈血測PAC和PRA水平。

1.6 診斷標(biāo)準(zhǔn) PA診斷金標(biāo)準(zhǔn)包括2項，滿足其中任意1項即可確診。(1)螺內(nèi)酯口服試驗：對于疑似PA患者予螺內(nèi)酯80 mg tid口服治療，并于門診持續(xù)隨訪，逐漸減少其他抗高血壓藥物至停用。若患者口服螺內(nèi)酯后，高血壓得到明顯控制，同時低鉀血癥得到改善，則確診PA；(2)手術(shù)切除：若雙側(cè)腎上腺靜脈采血提示患者腎上腺存在單側(cè)醛固酮優(yōu)勢分泌，則予以手術(shù)切除單側(cè)腎上腺，術(shù)后隨訪患者血壓、血鉀變化情況，若患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)則確診為PA。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：通過安體舒通試驗及手術(shù)治療確診PA患者57例，其中男性31例，女性26例，平均年齡(53.67±12.02)歲。原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)組患者70例，其中男性32例，女性38例，平均年齡(52.70±13.55)歲。2組患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、高血壓病程、血壓值等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。PA組患者的血鉀水平低于EH組，而血鈉及24 h尿鉀較EH組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組患者的一般資料比較

2.2 試驗前后PAC和PRA變化情況 結(jié)果(表2)顯示：CCT和SIT試驗前，PA組的PAC均明顯高于EH組，PRA均明顯低于EH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。在PA組和EH組中，CCT和SIT試驗后的PAC和醛固酮/腎素比值(aldosterone/renin concentration ratio，ARR)較試驗前均下降(P<0.001)。

表2 CCT和SIT試驗前后患者PAC、PRA和ARR的水平變化情況

2.3 CCT的診斷價值和最佳診斷截斷值 結(jié)果(圖1)顯示：CCT試驗后PAC、ARR及PAC抑制率對應(yīng)的AUC分別為0.876(95%CI 0.804～0.948)、0.902(95%CI 0.846～0.959)和0.751(95%CI 0.659～0.842)。三者相比，試驗后ARR的診斷價值最高。當(dāng)ARR=6.5時，YI值達到最大，診斷靈敏度為94.2%，特異度為78.0%。若以試驗后PAC絕對值為診斷指標(biāo)，PAC=34.8 pg/mL時診斷特異度可升至93.2%，但診斷的靈敏度降至75.5%。CCT中不同指標(biāo)的診斷價值見表3。

圖1 CCT診斷價值的ROC曲線

表3 CCT中不同指標(biāo)的診斷截斷值和診斷價值

2.4 SIT的診斷價值和最佳診斷截斷值 結(jié)果(圖2、表4)顯示： SIT后PAC、ARR及PAC抑制率對應(yīng)的AUC分別為0.881(95%CI 0.810～0.952)、0.823(95%CI 0.738～0.909)和0.652(95%CI 0.544～0.760)。SIT后PAC的診斷效率最高，PAC截斷值為24 pg/mL時YI達到最大，診斷靈敏度為87.2%，特異度為78.8%。

圖2 SIT診斷價值的ROC曲線

表4 SIT中不同指標(biāo)的診斷截斷值和診斷價值

2.5 CCT和SIT聯(lián)合診斷的價值 同時完成CCT和SIT的患者84例，若以CCT后ARR>6.5、SIT后PAC>24 pg/mL作為PA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定滿足其中之一即考慮為PA，則在84例患者中漏診2例，但誤診患者增加至15例，靈敏度和特異度分別為97.7%和82.2%。若以CCT后PAC>34.8 pg/mL、SIT后PAC>24 pg/mL作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，則在84例患者中漏診4例，誤診9例，靈敏度和特異度分別為95.3%和89.3%。

3 討 論

醛固酮是腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇激素之一，由血液中的膽固醇經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)合成。醛固酮在血液循環(huán)中的含量低至以pg/mL為單位，精確檢測存在困難。傳統(tǒng)檢測包括放射免疫法和化學(xué)發(fā)光法[6-7]，但由于與醛固酮代謝物及其他類固醇激素存在交叉反應(yīng)，這2種方法在檢測結(jié)果上都存在較大數(shù)據(jù)變異性，采用不同廠商和試劑檢測得到的結(jié)果缺乏可比性[8-9]。腎素檢測目前包括PRA和血漿腎素濃度2種方式。直接測定血漿腎素濃度更具成本和時間效益，但其與腎素原產(chǎn)生的交叉反應(yīng)可導(dǎo)致結(jié)果假陽性，此外還易受到雌激素的影響，檢測時需注意避開女性經(jīng)期[10]。而通過放射免疫法測PRA也存在免疫交叉干擾、線性窄、核素污染等問題，同時孵育時間、pH和酶抑制劑的選擇對PRA結(jié)果也會造成影響[11]。LC-MS/MS檢測可避免檢測時的交叉反應(yīng)，具有更高的檢測靈敏度和特異度，正逐漸取代免疫法成為類固醇激素檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。

美國內(nèi)分泌學(xué)會2016年指南推薦的PA確診試驗包括4種試驗，受限于試驗用藥和臨床操作，國內(nèi)目前開展較多的是SIT和CCT。CCT試驗操作簡便，不會增加循環(huán)容量負荷，不良反應(yīng)小，當(dāng)患者患有難以控制的高血壓或嚴(yán)重心功能不全時可作為首選試驗。正常人進行CCT時，作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的卡托普利抑制了體內(nèi)醛固酮生成，導(dǎo)致PAC降低。CCT診斷性能在東西方人群中的結(jié)果不一，Rossi等[14]在1 125例患者中篩查出317例陽性患者并進行CCT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAC取385 pmol/L(即13.9 ng/dL)時診斷價值最大，診斷靈敏度和特異度為69.6%和74%。我國和日本文獻[15-17]報道的CCT診斷性能較西方高，試驗后PAC診斷截斷值為11～25 ng/dL，亦有研究[18]認為以試驗后ARR作為診斷指標(biāo)時的診斷性能更佳。從指南角度出發(fā)，美國指南[4]認為非PA患者在CCT后的PAC抑制率應(yīng)大于30%，我國[5]和日本指南[19]推薦的診斷截斷值則分別為11 ng/dL和12 ng/dL。本研究共對111例患者進行CCT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)試驗后ARR取6.5時診斷性能最佳，此時在52例PA患者中漏診3例，59例EH組患者中誤診13例。同時，當(dāng)試驗后PAC截斷值為34.8 pg/mL(即3.48 ng/dL)時，診斷的特異度達93.2%，由于確診試驗較疾病篩查更需避免誤診，也可將CCT后PAC作為診斷標(biāo)準(zhǔn)截斷值。

SIT是目前應(yīng)用最為廣泛的PA確診試驗，但該試驗導(dǎo)致患者短時間內(nèi)的血容量明顯增加，可能誘發(fā)血壓劇烈升高、心力衰竭、電解質(zhì)紊亂等，在心功能不全、嚴(yán)重低鉀血癥的患者中應(yīng)謹慎使用。大部分研究均認可將試驗后PAC作為診斷指標(biāo)，但所得出的最佳截斷值及診斷價值存在較大差異。針對西方人群的研究[20-22]得出的截斷值多為6～7 ng/dL，美國指南推薦SIT后PAC>10 ng/dL可確診PA，<5 ng/dL時排除PA。有研究[4,15,17,23]表明，針對中國人群研究得到的最佳截斷值較西方國家偏高，SIT后PAC最佳截斷值波動在8～14.5 ng/dL。另外，SIT試驗具備一定的假陰性率。在一項以雙側(cè)腎上腺靜脈采血為診斷金標(biāo)準(zhǔn)的小樣本研究[24]中，SIT后PAC截斷值為5 ng/dL時，漏診率為29%，而當(dāng)截斷值取10 ng/dL時，漏診率升至37%。本研究對101例患者進行了SIT，其中2例因血壓過高終止試驗，總體認為SIT較安全。同樣對試驗后PAC、ARR和PAC抑制率3個指標(biāo)的分析結(jié)果提示，試驗后PAC診斷價值高于其他指標(biāo)。當(dāng)截斷值取24 pg/mL(2.4 ng/dL)時，靈敏度和特異度分別為87.2%和78.8%。

目前不同文獻報道的PA診斷截斷值存在明顯差異，造成差異的部分原因是研究人群及研究方案設(shè)計不同，如部分研究中使用氟氫可的松試驗作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但試驗自身也存在一定的假陽性與假陰性率。在各種影響因素中，檢測技術(shù)對試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。本研究基于LC-MS/MS技術(shù)探討PA確診試驗的診斷價值和截斷值，結(jié)果較指南和既往文獻推薦的數(shù)值均明顯降低，這可能與本研究采用的檢測方法為LC-MS/MS有關(guān)。既往研究[25]發(fā)現(xiàn)，LC-MS/MS檢測下的PAC水平較放射免疫法降低約30%。同時需要注意的是，在進行CCT的111例患者中，66%的患者試驗前的PAC小于100 pg/mL，基礎(chǔ)PAC水平對結(jié)果會造成一定影響，而本研究中試驗后PAC抑制率的診斷價值偏低同樣也可能與此相關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，CCT和SIT聯(lián)合試驗可進一步提高診斷效率，考慮到確診試驗對特異度要求較高，建議將CCT后PAC和SIT后PAC作為聯(lián)合試驗的診斷指標(biāo)。

綜上所述，CCT試驗后ARR和PAC均可作為PA的診斷指標(biāo)，診斷截斷值為6.5 pg/mL和34.8 pg/mL；SIT后PAC的診斷截斷值為24 pg/mL。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷普及，未來還需針對LC-MS/MS技術(shù)診斷PA進行更加深入的臨床研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。