自噬調(diào)控巨噬細胞參與構(gòu)建腫瘤微環(huán)境研究進展

高 正，陳佳鋒，傅修濤，丁振斌

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科，上海 200032

自噬是生物進化過程中高度保守的細胞活動，通過參與物質(zhì)循環(huán)利用來維持細胞穩(wěn)態(tài)。根據(jù)降解物進入溶酶體的方式，將自噬分為3類：巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬[1]。腫瘤微環(huán)境中廣泛存在誘導(dǎo)自噬的因素，包括低氧環(huán)境、營養(yǎng)匱乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、ATP/AMP比值下調(diào)等。自噬和腫瘤微環(huán)境能夠相互作用，從而影響腫瘤進展[2]。巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境最關(guān)鍵的基質(zhì)細胞之一，對腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療起重要作用。本文就自噬通過調(diào)控巨噬細胞參與腫瘤微環(huán)境構(gòu)建的機制及意義進行綜述。

1 自噬過程概述

經(jīng)典自噬過程為mTOR和AMPK通過感知能量變化而激活蛋白激酶復(fù)合物ULK(Unc-51-Like kinase)，繼而通過膜泡分揀蛋白34(vacuolar protein sorting 34，VPS34)促進吞噬泡形成，自噬降解物與接頭蛋白SQSTM1/p62結(jié)合促進自噬體形成，自噬體進一步與溶酶體融合形成自噬溶酶體后降解胞內(nèi)物質(zhì)[3-4]。自噬以形成雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)為特征，其過程包括自噬體起始、延長、閉合及自噬體與溶酶體融合[5]。起始階段ULK激酶復(fù)合物

活化Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)，產(chǎn)生3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)[6]，招募WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域磷酸肌醇相互作用蛋白2(WIPI2)和雙FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白1(DFCP1)作為結(jié)合蛋白參與自噬體膜的形成[7-8]；隨后自噬體通過2個泛素化修飾過程進行延長。其中自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)與ATG12共價連接后，與ATG16L相互作用形成自噬前體[9]；磷脂酰乙醇胺(PE)與自噬相關(guān)蛋白ATG8/LC3結(jié)合后，形成膜結(jié)合LC3Ⅱ誘導(dǎo)自噬體延長和閉合，最終形成自噬溶酶體[10]。

在分子水平上，PI3K-AKT-mTOR信號通路、AMPK-TSC1/2-mTOR等信號通路參與自噬調(diào)控，其中mTOR是自噬負調(diào)控的關(guān)鍵分子。AMPK則在胞內(nèi)低ATP水平時通過磷酸化TSC2抑制mTOR活性，誘導(dǎo)自噬發(fā)生。因此胞內(nèi)ATP水平、缺氧等細胞信號可將自噬整合入腫瘤調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而影響腫瘤發(fā)展。除經(jīng)典通路外，活化的FOXO可通過PI3K-AKT-FOXO通路以谷氨酰胺合成酶依賴的方式抑制mTOR而誘導(dǎo)自噬[11]。p53則在DNA損傷時通過誘導(dǎo)生成應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白Sestrin激活A(yù)MPK，進而活化TSC，抑制mTORC，誘導(dǎo)自噬[12]。此外，紫外線抵抗相關(guān)基因(UVRAG)可通過與Beclin-1相互作用活化PI3K，進而提高自噬水平[13]；而Bcl-2與Beclin-1相互作用后則可抑制PI3K的活性，從而降低自噬水平。應(yīng)激條件下，Bcl-2從Beclin-1/PI3K復(fù)合物中分離，打破其與UVRAG間的平衡，進而提高自噬水平[14-15]。

2 巨噬細胞參與構(gòu)建腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境，即腫瘤細胞形成和生存的內(nèi)環(huán)境，包括腫瘤細胞及其周圍的免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等非腫瘤細胞，同時包括細胞間質(zhì)、微血管及各種生物分子。巨噬細胞作為構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵免疫細胞參與早期腫瘤形成、進展及轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞極化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)并具有很強的可塑性。根據(jù)刺激源的不同，TAMs主要分為2個表型：M1樣抗腫瘤表型和M2樣促腫瘤表型。其中干擾素-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)M1型TAMs形成，而白細胞介素4(IL-4)、IL-10等細胞因子則促進M2型TAMs形成。多數(shù)研究[16-17]顯示，在已形成的腫瘤體系中，M2型TAMs占比較高，高表達CD163、CD206，并分泌抗炎細胞因子、血管生長因子等，從而抑制腫瘤微環(huán)境免疫、促進腫瘤血管生成。

腫瘤形成起始階段，TAMs通過誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境炎癥反應(yīng)促使上皮細胞基因穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)癌變[18]；同時，TAMs通過產(chǎn)生表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6等形成誘變微環(huán)境，從而激活腫瘤細胞[19]。在腫瘤進展階段，TAMs通過分泌多種促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)等促進腫瘤微環(huán)境血管新生[20]。腫瘤轉(zhuǎn)移則涉及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成、血管內(nèi)浸潤、循環(huán)腫瘤細胞生存、血管外侵出及定植于轉(zhuǎn)移部位等多個步驟。此外，TAMs可分泌多種蛋白降解酶，進而介導(dǎo)腫瘤細胞與胞外基質(zhì)間的相互作用，通過重建胞外基質(zhì)促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[21]。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的M2型TAMs通過表達CD11b/CD18來活化肝癌細胞金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)信號通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Wei等[23]發(fā)現(xiàn)，CD163+TAMs通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/miR-506-3P/FoxQ1軸誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進結(jié)直腸癌細胞侵犯及轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞免疫逃逸是調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件，而微環(huán)境中的M2型TAMs通過分泌趨化因子(如CCL5、CCL22)招募Treg細胞，同時能分泌IL-10、TGF等，進而抑制T細胞免疫反應(yīng)[24]。

3 自噬調(diào)控腫瘤微環(huán)境

腫瘤細胞與非腫瘤細胞以自噬為媒介對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響[25]。有研究[26]顯示，腫瘤細胞自噬可以調(diào)節(jié)程序性死亡受體配體-1(PD-L1)表達，進而逃避微環(huán)境中免疫細胞的殺傷，促進免疫逃逸。Yamamoto等[27]也發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管癌細胞表面表達的主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ(MHC-Ⅰ)可被NBR1介導(dǎo)的選擇性自噬所降解，并導(dǎo)致免疫逃逸。此外，乏氧環(huán)境中的腫瘤細胞可通過自噬降解縫隙連接蛋白43，抑制黑素瘤細胞與自然殺傷細胞間免疫突觸的形成，進而抑制自然殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[28]。同時，腫瘤細胞可形成自噬泡，通過包裹和吞噬細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞所分泌的細胞毒性分子顆粒酶B，從而抵抗其細胞毒性作用[29]。

非腫瘤細胞也可通過自噬以不同方式作用于腫瘤細胞。New等[30]發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)自噬激活后，可分泌細胞因子IL-6、IL-8等，進而促進腫瘤侵犯和轉(zhuǎn)移。同時腫瘤細胞通過旁分泌IL-6、IL-8進一步提高CAFs自噬水平，進而在腫瘤微環(huán)境中形成自噬反饋環(huán)路。Sousa等[31]發(fā)現(xiàn)，在胰腺腫瘤微環(huán)境中，胰腺星形細胞以自噬性蛋白分解的方式產(chǎn)生丙氨酸，之后丙氨酸被腫瘤細胞攝取，為腫瘤生長提供可替代性碳源。而常規(guī)來源的碳(如葡萄糖)則用于更重要的生物合成過程，如產(chǎn)生絲氨酸和甘氨酸以保障腫瘤細胞核酸合成。內(nèi)皮細胞自噬也可參與腫瘤血管生成。腫瘤基質(zhì)中透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)促進透明質(zhì)酸沉積是腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的重要條件。Chen等[32]的研究表明，通過血管生成抑制劑抑制mTOR提高自噬水平，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)HAS2的自噬性降解，降低基質(zhì)中透明質(zhì)酸水平，從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成效應(yīng)。

4 自噬調(diào)控巨噬細胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用

4.1 自噬可通過介導(dǎo)巨噬細胞極化構(gòu)建腫瘤微環(huán)境 在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞極化為M2型TAMs后調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境和腫瘤免疫反應(yīng)是其發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，自噬則是介導(dǎo)巨噬細胞極化不可或缺的重要條件。Wen等[26]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞來源自噬小體(TRAPs)通過Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的MyD88-p38-STAT3信號通路誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型TAMs轉(zhuǎn)化，此外TRAPs能以TLR4-MyD88依賴的方式介導(dǎo)巨噬細胞免疫抑制功能；TRAPs通過抑制p38活化，降低STAT3磷酸化水平，誘導(dǎo)TAMs表達PD-L1、IL-10和CD163，同時抑制TAMs表達人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)，從而促進腫瘤細胞免疫逃逸。這些結(jié)果表明腫瘤細胞能以分泌自噬小體的方式，誘導(dǎo)巨噬細胞向M2表型極化，形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。

肝腫瘤來源的TLR2相關(guān)配體能以選擇性自噬的方式，調(diào)控NF-κB RELA/p65蛋白穩(wěn)態(tài)，從而刺激TAMs向M2型極化[33]。Shiau等[34]發(fā)現(xiàn)，肝腫瘤來源的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)通過TLR2受體活化NADPH氧化酶2(NOX2)，刺激活性氧類(ROS)以NOX2依賴的方式生成，并提高巨噬細胞自噬水平，之后泛素化的NF-κB相關(guān)細胞溶質(zhì)通過SQSTM1/p62介導(dǎo)的選擇性自噬作用被降解，促使巨噬細胞向M2型TAMs極化，形成抑制性腫瘤微環(huán)境。上述結(jié)果表明抑制自噬，提高NF-κB活性或許可減少巨噬細胞向M2型TAMs極化。

此外，Yang等[35]發(fā)現(xiàn)，TAMs內(nèi)組織蛋白酶S(Cat S)缺乏可導(dǎo)致巨噬細胞內(nèi)自噬體形成增加、降解減少，從而降低TAMs的自噬通量，同時抑制巨噬細胞向M2型TAMs極化；用氯喹抑制野生型和Cat S-/-巨噬細胞自噬后發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸癌細胞共培養(yǎng)的野生型巨噬細胞有精氨酸酶1、IL-10等M2表型特異性基因表達增加，而Cat S-/-巨噬細胞無相應(yīng)變化。這些證據(jù)表明，Cat S介導(dǎo)的自噬通量降低是誘導(dǎo)TAMs向M2型極化，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要機制。

4.2 自噬通過與代謝相互作用調(diào)控巨噬細胞影響微環(huán)境 自噬作為一種胞內(nèi)物質(zhì)降解途徑，與細胞內(nèi)代謝過程存在著廣泛聯(lián)系。尤其在腫瘤細胞高代謝狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境營養(yǎng)匱乏的背景下，TAMs需要通過自噬和代謝重編程為其在微環(huán)境內(nèi)的生存提供支持。高水平線粒體自噬和氨基酸代謝可支持巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中生存。Xia等[36]發(fā)現(xiàn)，T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子4陽性TAMs(Tim-4+TAMs)內(nèi)，精氨酸酶1可通過將精氨酸轉(zhuǎn)化為下游代謝物，包括鳥氨酸和尿素等，控制巨噬細胞內(nèi)精氨酸水平；mTOR則通過感知精氨酸及其代謝物水平，使其自身活化，調(diào)控Tim-4+TAMs內(nèi)線粒體自噬水平，降解損傷線粒體，清除ROS，從而避免卵巢癌微環(huán)境中的巨噬細胞死亡，促進腫瘤進展。

此外，自噬可通過參與巨噬細胞脂肪酸氧化支持巨噬細胞向M2表型極化。Dai等[37]的研究表明，腫瘤微環(huán)境中發(fā)生氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管癌細胞發(fā)生自噬依賴性鐵死亡，死亡的腫瘤細胞釋放KRASG12D，并與巨噬細胞晚期糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，通過活化STAT3而上調(diào)肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A和中鏈?；o酶 A 脫氫酶的活性，進一步促進脂肪酸氧化，從而驅(qū)動巨噬細胞向M2型TAMs轉(zhuǎn)化。

腫瘤微環(huán)境有限的氧供和營養(yǎng)物質(zhì)促使巨噬細胞通過代謝重編程維系自身存活。自噬作為構(gòu)建腫瘤微環(huán)境和促進巨噬細胞向M2型極化的關(guān)鍵因素，通過參與多種代謝過程，如糖酵解、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝及核酸代謝，使巨噬細胞代謝重編程有較高的可塑性。然而，自噬與代謝相互作用調(diào)控巨噬細胞影響腫瘤微環(huán)境的具體分子機制仍未闡釋清楚，同時不同類型實體瘤微環(huán)境內(nèi)自噬激活的巨噬細胞代謝譜與正常巨噬細胞的不同之處也有待進一步明確。

4.3 自噬通過促進巨噬細胞吞噬作用影響腫瘤微環(huán)境 作為腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵免疫細胞，成熟巨噬細胞在微環(huán)境內(nèi)經(jīng)活化后能有效發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬能夠活化巨噬細胞，并提高其對微環(huán)境內(nèi)腫瘤細胞的吞噬能力。Yang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ通過上調(diào)吲哚胺2,3-雙加氧酶1(IDO1)增加色氨酸的消耗及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的積累，促使宮頸癌細胞自噬水平升高。共培養(yǎng)自噬激活的宮頸癌細胞和巨噬細胞可誘導(dǎo)巨噬細胞CD80、CD86或CD163表達升高，同時巨噬細胞對自噬活躍的腫瘤細胞吞噬能力增強，表明IFN-γ可通過IDO1-犬尿氨酸-自噬通路促進巨噬細胞活化，提高巨噬細胞吞噬能力，從而抑制腫瘤進展。

Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)，CD47靶向融合蛋白SIRPαD1-Fc通過抑制CD47-SIRPα通路促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬及細胞毒活性。同時，SIRPαD1-Fc也會觸發(fā)細胞保護性自噬機制。經(jīng)SIRPαD1-Fc處理后，腫瘤細胞ROS生成增加，AKT-mTOR信號通路失活，從而提高腫瘤細胞自噬水平，抵抗SIRPαD1-Fc的腫瘤殺傷作用。降低自噬核心蛋白(如ATG5)表達，抑制經(jīng)SIRPαD1-Fc處理的腫瘤細胞自噬則可進一步提高巨噬細胞介導(dǎo)的吞噬和細胞毒作用。此外，同時靶向自噬和CD47能招募更多巨噬細胞到達腫瘤位點發(fā)揮吞噬作用。

由此推測，自噬影響巨噬細胞吞噬和細胞毒作用、抑制腫瘤微環(huán)境的促癌效應(yīng)。但上述研究均未深入探討自噬影響巨噬細胞吞噬和細胞毒作用所涉及的具體分子通路和調(diào)控位點。未來應(yīng)基于單細胞測序等技術(shù)，從基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等水平探尋自噬調(diào)控巨噬細胞吞噬和細胞毒作用的基因位點及具體分子機制。

4.4 靶向自噬發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng) 鑒于自噬對巨噬細胞的調(diào)控及其與腫瘤微環(huán)境間的相互作用，以及自噬在低氧、營養(yǎng)匱乏的微環(huán)境中是維系腫瘤生存及產(chǎn)生耐藥性的重要機制，靶向自噬，增強或抑制其對微環(huán)境內(nèi)巨噬細胞和腫瘤細胞的調(diào)控作用或許可起到抗腫瘤效應(yīng)。

目前一般認為抑制自噬應(yīng)作為腫瘤治療的主流方式。Guo等[40]研究發(fā)現(xiàn)，通過氯喹抑制自噬可誘導(dǎo)M2型TAMs向M1型轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)TAMs復(fù)極化。復(fù)極化的TAMs 對腫瘤細胞的吞噬能力更強，同時可恢復(fù)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。Tan等[41]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可促進M2型TAMs內(nèi)SQSTM1/p62介導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)自噬性降解，促使IKKα活性增強，活化RelB/p52通路，誘導(dǎo)TAMs復(fù)極化。此外，F(xiàn)u等[42]研究表明，TAMs可激活肝癌細胞自噬并抵抗奧沙利鉑的腫瘤細胞殺傷作用，敲除自噬基因ATG5則可增強奧沙利鉑的細胞毒作用。因此，細胞毒性藥物聯(lián)合自噬抑制劑或許能更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

然而，有學(xué)者提出，激活自噬同樣能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。Wang等[43]發(fā)現(xiàn)，用于腫瘤治療的人重組精氨酸酶1(rhArg1)能通過下調(diào)微環(huán)境內(nèi)巨噬細胞的自噬水平而誘導(dǎo)其免疫抑制功能；反之，激活自噬則能改善rhArg1誘導(dǎo)的巨噬細胞免疫抑制功能，而活化免疫殺傷效能。因此，選擇抑制還是激活自噬調(diào)控巨噬細胞對于腫瘤預(yù)后和化療療效具有重要影響。

綜上所述，自噬作為參與調(diào)節(jié)多個生物學(xué)過程的重要機制，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。同時巨噬細胞作為微環(huán)境中重要的非腫瘤細胞，通過極化為M2型TAMs在促進腫瘤侵犯、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面起重要作用，同時可發(fā)揮免疫抑制功能。自噬能調(diào)控巨噬細胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用，但詳細機制仍缺乏深入研究，如自噬是直接作為巨噬細胞極化、代謝和吞噬等過程的一部分，還是通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化、代謝及吞噬過程中關(guān)鍵蛋白的生成或降解，從而調(diào)控腫瘤微環(huán)境都尚未明確。此外，自噬調(diào)控巨噬細胞在腫瘤不同時期發(fā)揮抑癌還是促癌作用也尚無定論，同時如何進行針對性治療也值得進一步探討。因此，未來研究應(yīng)著重在分子層面闡釋自噬通過調(diào)控巨噬細胞構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的機制，基于測序平臺聯(lián)合多組學(xué)(如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué))篩選自噬調(diào)控巨噬細胞的基因位點，揭示自噬調(diào)控巨噬細胞的分子分類，同時將其運用于臨床實踐，進而構(gòu)建新型預(yù)后和治療分層模型，或制定與化療藥物、分子靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用的具體方案，從而為腫瘤治療提供新思路。