林大成,萬一來,陳 靜,2,王宇峰,莫 萍
1.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院,廣西 欽州 535011
2.北部灣大學(xué) 北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 欽州 535011
3.北部灣大學(xué) 欽州市特色果蔬發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 欽州 535011
4.廣西靈山縣宇峰保健食品有限公司,廣西 靈山 535400
火龍果(Hylocereuspolyrhizus)又稱紅龍果、仙人果、仙蜜果及龍珠果等[1],其果肉營(yíng)養(yǎng)豐富,甜菜苷與甜菜紅素含量高,還含有單元不飽和脂肪酸(油酸、棕櫚油酸、順-11-十八碳烯酸)、多元不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)及多酚物質(zhì),具有抗氧化、降血脂、降血糖等生理生化活性[2-3]?;瘕埞菦鲂运呃w維、低脂、低糖并含有一般水果少有的植物蛋白,適合做涼茶飲料,是夏日運(yùn)動(dòng)補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)的最佳健康飲品。目前對(duì)火龍果復(fù)合飲料的研究較多,如玫瑰、圣女果、綠茶、菠蘿、柑橘、蘋果、蜜茶等火龍果飲料[1,4-10]。也有在火龍果汁中添加活性菌或酸奶發(fā)酵的研究[11-13],該產(chǎn)品具有雙重營(yíng)養(yǎng)保健功效。
現(xiàn)代保健養(yǎng)生概念盛行,兼具藥食同源的中藥草本植物有望成為飲料界的新興應(yīng)用原料。一般涼茶在制作工藝中,都加入菊花、金銀花、羅漢果、決明子、甘草、薄荷、夏枯草、蒲公英及淡竹葉等中藥草本植物,具有保健養(yǎng)生的功效。兼具口感、營(yíng)養(yǎng)與保健養(yǎng)生的火龍果汁涼茶飲料很少見,其所含的甜菜色素與抗氧化保健功能的量效關(guān)系亦少有探討,因此開發(fā)保健型火龍果汁涼茶飲料具有重要意義。
火龍果、檸檬:廣西欽州;仙草:廣西靈山縣宇峰保健食品有限公司;中藥(山藥、枸杞、紅曲):西安百慶生物科技有限公司;優(yōu)質(zhì)白砂糖、混合乳酸菌種(嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌):山東菌樂生物科技有限公司;MRS培養(yǎng)基:杭州百思生物技術(shù)有限公司。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鐵氰化鉀、亞油酸、硫酸氰氨、菲洛嗪(Ferrozine)、Folin-Ciocalteu、乙二胺四乙酸(Sigma):西安熱默爾生物科技有限公司;乙醇、抗壞血酸、苯酚、葡萄糖、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化亞鐵、磷酸鹽緩沖液(pH 6.6、pH 7.4)等:分析純,廣州柏研生物科技有限公司。
TG16 MW臺(tái)式高速離心機(jī):湖南赫西儀器裝備有限公司;Evolution 201 & 220紫外-可見光分光光度計(jì):上海譜祥科學(xué)儀器有限公司;YH-200DH超聲波振蕩器:上海予皓科學(xué)儀器有限公司; AE300 L-H臺(tái)式高速均質(zhì)機(jī): 深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;BPH-9272恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KTNK-80冷凍干燥機(jī):上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司。
原料(火龍果、檸檬)→榨汁→配料(仙草汁、中藥濃縮液、糖)→純水混勻→巴氏滅菌→冷卻→接種乳酸菌→42 ℃、24 h發(fā)酵培養(yǎng)→均質(zhì)→離心→過濾→巴氏滅菌→封罐→成品。
以MRS培養(yǎng)基添加經(jīng)蒸煮提煉的中藥濃縮液1%(m山藥∶m枸杞∶m紅曲=1∶ 1∶ 1),培養(yǎng)混合乳酸菌(1%,m嗜酸乳桿菌∶m德氏乳桿菌保加利亞亞種∶m嗜熱鏈球菌=1∶ 1∶ 1)作為試驗(yàn)組(EX),同時(shí)以僅添加乳酸菌發(fā)酵為控制組(CL), 僅添加中藥為對(duì)照組(CK)及純火龍果汁為空白組(BK)進(jìn)行抗氧化功能評(píng)估,并測(cè)定總酚與甜菜苷色素含量,分析抗氧化的保健機(jī)理及量效關(guān)系。仙草汁與中藥濃縮液的制備方法為各取5 g樣品加蒸餾水300 mL,蒸煮至150 mL后過濾備用。
單因素試驗(yàn)主要考察糖添加量(10%、12%、14%、16%、18%)、中藥濃縮液添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌種添加量(4%、6%、8%、10%、12%)及檸檬汁添加量(6%、7%、8%、9%、10%)對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)價(jià)的影響,其中火龍果汁體積占涼茶體積的20%,以保證果汁的發(fā)酵質(zhì)量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn),確定優(yōu)化配方。當(dāng)選取某個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí),其他因素條件固定選擇第3個(gè)水平。
火龍果汁涼茶的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]并稍加修改,見表1。由30名食品專業(yè)的學(xué)生擔(dān)任感官評(píng)價(jià)員,分3組對(duì)不同處理的樣品進(jìn)行感官評(píng)定。
表1 火龍果汁涼茶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
抗氧化功能評(píng)估采用DPPH清除能力、還原力、亞鐵離子螯合作用及亞油酸過氧化抑制作用等指標(biāo), 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[14-15]并稍加修改,其中陽(yáng)性對(duì)照組(positive control, PC):亞鐵離子螯合作用為EDTA,其余3項(xiàng)為VC??偡雍?total phenolic content, TPC)測(cè)定采用 Folin-Ciocalteu法, 以沒食子酸為陽(yáng)性對(duì)照, 參考文獻(xiàn)[16]的方法。各試驗(yàn)樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。
采用超聲波水提法提取火龍果汁涼茶中甜菜苷色素,其含量用摩爾消光系數(shù)法測(cè)定,參考文獻(xiàn)[17]并稍加修改。首先稱取一定量的火龍果汁涼茶飲料置于離心管中,用超聲波振蕩器振蕩20 min,以10 000 r/min離心10 min提取紅色素。再以RO水稀釋一定倍數(shù),與蒸餾水進(jìn)行對(duì)照,在535 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算紅色素含量。
C=D(535)×MW×V×DF×100/(ε×L×W),
式中:C為待測(cè)樣品中甜菜苷紅色素質(zhì)量濃度,g/L;DF為稀釋倍數(shù);MW為標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾質(zhì)量,550.46 g/mol;V為樣品溶液體積,mL;L為試管的透光路徑長(zhǎng)度,cm;W為新鮮原料的質(zhì)量,g;ε為標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾消光系數(shù),61 600 L·cm-1·mol-1。
總糖的測(cè)定參照GB/T 15672—2009;總酸的測(cè)定參照GB/T 12456—2008。
菌落總數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.2—2010;大腸桿菌的測(cè)定參照GB 4789.3—2010。
所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值??寡趸δ苤笜?biāo)之間的比較采用Duncan多重比較。
4個(gè)單因素對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響見表2。
表2 單因素對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響
2.1.1 糖添加量對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響
由表2可知,隨著糖添加量的增加,火龍果汁涼茶的感官評(píng)分先上升后下降。糖添加量的變化主要影響乳酸菌的生長(zhǎng)與發(fā)酵作用,產(chǎn)生的胞外多糖具有乳化穩(wěn)定溶液的效果,可以改善涼茶的口感和質(zhì)地[18]。當(dāng)糖添加量為14%時(shí),感官評(píng)分最高為88.5±2.2,與10%和18%時(shí)的感官評(píng)分具有顯著差異,此時(shí)產(chǎn)品酸甜適中,口感良好。
2.1.2 中藥濃縮液添加量對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響
由表2可知,中藥濃縮液添加量1%~3%時(shí),火龍果汁涼茶的感官評(píng)分逐步上升,至4%時(shí)感官評(píng)分則陡然下降。中藥成分濃度不高時(shí),涼茶口感尚可,風(fēng)味也行;當(dāng)中藥濃縮液添加量超過4%時(shí),涼茶稍有苦味,風(fēng)味也不佳,可能是中藥本草過量的單寧、黃酮等苦澀物質(zhì)所致[19]。故最適中藥濃縮液添加量為3%,此時(shí)感官評(píng)分最高87.4±2.8,與其他添加量的評(píng)分具有顯著差異。
2.1.3 菌種添加量對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響
由表2可知,火龍果汁涼茶的感官評(píng)分隨菌種添加量的增加先增加而后降低。菌種添加量較少時(shí),發(fā)酵不充分,口感不佳,風(fēng)味也不足。在一定發(fā)酵時(shí)間,隨著菌種添加量的增加發(fā)酵更充分,風(fēng)味也濃郁,但過量時(shí)會(huì)造成發(fā)酵過度,菌體過量繁殖導(dǎo)致酸度過高,涼茶穩(wěn)定性稍差,有沉淀混濁現(xiàn)象,可能是過量菌體與發(fā)酵底物黏稠度增加所致[12,20-21]。故最適菌種添加量為10%,此時(shí)感官評(píng)分最高88.5±2.7,與其他添加量的評(píng)分具有顯著差異。
2.1.4 檸檬汁添加量對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分的影響
由表2可知,隨著檸檬汁添加量的增加,火龍果汁涼茶的感官評(píng)分先上升后下降。檸檬汁的添加提供酸性環(huán)境促進(jìn)乳酸菌的活性[22],使火龍果汁涼茶具有良好的發(fā)酵特征風(fēng)味。當(dāng)檸檬汁添加量達(dá)7%時(shí),感官評(píng)分最高86.5±2.1,與其他添加量的感官評(píng)分具有顯著差異,此時(shí)涼茶酸甜比例適中(糖酸比2∶ 1)、pH(4.2±0.2),與文獻(xiàn)[3]相當(dāng),口感效果最佳,火龍果果肉中甜菜苷色素的穩(wěn)定性也佳[23]。檸檬汁添加量多會(huì)導(dǎo)致過酸,將組織成分析出而致混濁分層,造成透光率降低從而影響澄清度[5],口感也不佳。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn),因素與水平見表3,試驗(yàn)結(jié)果見表4。各因素對(duì)火龍果汁涼茶感官評(píng)分影響的主次順序?yàn)锽>C>A>D,最優(yōu)組合為A2B3C2D2,即糖添加量14%、中藥濃縮液添加量3%、菌種添加量10%、檸檬汁添加量7%。該組合不在正交試驗(yàn)表中,故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果該組合的產(chǎn)品感官評(píng)分為93.5±1.1,高于正交試驗(yàn)中試驗(yàn)6的產(chǎn)品評(píng)分,說明正交試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可行。最佳糖酸比為2∶ 1,可強(qiáng)化果汁涼茶的口感,與劉雅[9]研究的糖添加量15%的效果相當(dāng);也與吳德智等[1]研究的糖酸比1.8∶ 1相近;另外本草中藥對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響最大,因其富含多糖、氨基酸及礦物質(zhì)等多種活性成分,可產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用與涼茶特征風(fēng)味[24-25]。另外一般中藥成分多含有單寧酸,可抑制病毒的蛋白酶活性,對(duì)抑菌也有一定的功效,可提高機(jī)體免疫力和保健效果[14,26]。
表3 正交試驗(yàn)因素與水平
表4 正交試驗(yàn)結(jié)果
方差分析見表5,在不考慮交互作用的情況下,糖添加量、中藥濃縮液添加量、菌種添加量及檸檬汁添加量對(duì)火龍果汁涼茶的感官評(píng)分都有極顯著影響(P<0.01),其中再次驗(yàn)證中藥濃縮液添加量對(duì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)影響最大。故火龍果汁涼茶的最佳組合為A2B3C2D2,即糖添加量14%、中藥濃縮液添加量3%、菌種添加量10%、檸檬汁添加量7%。
表5 方差分析
2.4.1 DPPH自由基清除能力
DPPH 自由基清除能力可作為抗氧化劑的強(qiáng)弱指標(biāo), 是維持人體內(nèi)自由基平衡的重要因素之一[14-15]。如圖 1所示,各組DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)樵囼?yàn)組(EX)、控制組(CL)、對(duì)照組(CK)、空白組(BK),對(duì)DPPH自由基清除率分別為(88.4±1.8)%、(77.5±2.1)%、(71.8±2.4)%、(66.8±2.2)%, EX的效果是CL的1.1~1.2倍, 是CK的1.2~1.3倍, 是BK的1.3~1.4倍, 可知試驗(yàn)組顯著優(yōu)于各組,說明試驗(yàn)組對(duì)DPPH 自由基清除能力有促進(jìn)作用。據(jù)研究報(bào)道,火龍果中主要的抗氧化成分是甜菜色素和酚類物質(zhì),而中藥濃縮液中的紅曲成分可以促進(jìn)乳酸菌生化反應(yīng)的酶系統(tǒng),產(chǎn)生胞外多糖具有乳化作用,可穩(wěn)定甜菜苷色素增加酚類物質(zhì),同時(shí)中藥活性物質(zhì)刺激乳酸菌生化反應(yīng)使蛋白結(jié)合酚(protein-polyphenol complexes, PPC)分解釋出游離酚,提高總酚含量從而提升其清除自由基的抗氧化功能[18,27]。因此,乳酸菌外源酶的生化作用促進(jìn)火龍果與仙草內(nèi)存的結(jié)合型多酚釋出,轉(zhuǎn)為自由型多酚從而增加抗氧化力;另外乳酸菌內(nèi)源酶的生化作用不斷產(chǎn)生動(dòng)態(tài)的胞外多糖,也比中藥存在的靜態(tài)多糖多從而提高抗氧化力[28],此二者都使得添加乳酸菌的控制組對(duì)DPPH 自由基清除能力優(yōu)于對(duì)照組。
2.4.2 還原力
還原力(RP)可作為抗氧化劑能力的評(píng)估指標(biāo)之一。如圖1所示,各組還原能力的強(qiáng)弱順序?yàn)樵囼?yàn)組、控制組、對(duì)照組、空白組,其還原力分別為0.86±0.05、0.74±0.03、0.63±0.02、0.55±0.04,試驗(yàn)組的效果是控制組的1.1~1.3倍, 是對(duì)照組的1.2~1.5倍, 是空白組的1.4~1.8倍, 可知試驗(yàn)組顯著優(yōu)于其他組,說明試驗(yàn)組含有的中草藥對(duì)還原力有促進(jìn)作用。據(jù)研究報(bào)道中藥濃縮液中的紅曲發(fā)酵后可產(chǎn)生輔酶Q10,是細(xì)胞代謝與細(xì)胞呼吸的激活劑,可以促進(jìn)乳酸菌生化反應(yīng)的酶系統(tǒng),可顯著提高樣品的還原力,使其具有抗氧化功能和效果[19,25,29]。
2.4.3 亞鐵離子螯合作用
亞鐵離子螯合作用(FC)也可作為抗氧化劑能力的評(píng)估指標(biāo)之一,因?yàn)檫^渡金屬在脂質(zhì)氧化過程中具有催化作用。由于亞鐵在過渡金屬中具有相當(dāng)高的反應(yīng)活性,因此成為最重要的脂類氧化促進(jìn)劑,所以對(duì)亞鐵離子的螯合作用是一種抗氧化機(jī)制的體現(xiàn)[15]。如圖1所示,各組對(duì)亞鐵離子的螯合能力強(qiáng)弱順序?yàn)樵囼?yàn)組、控制組、對(duì)照組、空白組,對(duì)亞鐵離子的螯合能力分別為(73.7±2.3)%、(68.6±2.6)%、(63.5±2.4)%、(58.1±2.5)%,試驗(yàn)組的效果是控制組的1.1~1.2倍, 是對(duì)照組的1.2~1.3倍, 是空白組的1.3~1.5倍, 可知試驗(yàn)組顯著優(yōu)于其他組,說明試驗(yàn)組含有的中草藥對(duì)亞鐵離子螯合能力有促進(jìn)作用。據(jù)研究報(bào)道,中藥濃縮液中山藥含有的膠原蛋白多糖物質(zhì)具有乳化效果,可穩(wěn)定火龍果中甜菜色素物質(zhì)與甜菜苷成分,并激活抗氧化防御系統(tǒng),發(fā)揮抗氧化作用[2,26,30]。
注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
2.4.4 亞油酸過氧化的抑制作用
如圖1所示,各組對(duì)亞油酸過氧化的抑制作用(AOA)能力強(qiáng)弱順序?yàn)樵囼?yàn)組、控制組、對(duì)照組、空白組,對(duì)亞油酸過氧化的抑制能力分別為(54.5±3.4)%、(48.6±2.2)%、(42.8±2.1)%、(35.4±2.8)%,試驗(yàn)組的效果是控制組的1.1~1.3倍, 是對(duì)照組的1.2~1.5, 是空白組的1.4~1.9倍, 可知試驗(yàn)組顯著優(yōu)于其他組,說明試驗(yàn)組含有的中草藥對(duì)亞油酸過氧化的抑制能力有促進(jìn)作用。據(jù)研究報(bào)道,中藥濃縮液中的枸杞富含多糖物質(zhì),可與乳酸菌的胞外多糖共同作用,增強(qiáng)乳化性,穩(wěn)定仙草或中藥本草中的酚類物質(zhì),提供電子形成穩(wěn)定的自由基中間體,從而提高抗氧化功能[2,19,24]。
2.4.5 總酚含量
總酚(TPC)是抗氧化劑的重要成分之一[14,18]。酚類抗氧化劑的一個(gè)重要的機(jī)制是將Fe(III)離子以螯合方式穩(wěn)定成還原態(tài)的Fe(II) 離子,阻止油脂過氧化,因此,F(xiàn)e(III)離子的還原作用常被作為提供電子的活性劑,與其他抗氧化劑性質(zhì)密切相關(guān)[24]。如圖1所示,各組總酚含量由大到小為試驗(yàn)組、控制組、對(duì)照組、空白組,分別為(29.6±0.5)、(25.3±0.6)、(22.7±0.8)、(16.5±0.7) mg/g,試驗(yàn)組的總酚含量是控制組的1.1~1.2倍, 是對(duì)照組的1.2~1.4倍, 是空白組的1.7~1.9倍, 可知試驗(yàn)組顯著優(yōu)于其他組,說明試驗(yàn)組中的中草藥對(duì)總酚的生成有促進(jìn)作用。據(jù)研究報(bào)道中藥濃縮液中的紅曲可促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵提升總酚含量,從而增進(jìn)抗氧化功能[24,29]。由于總酚含量與胞外多糖及抗氧化活性呈正相關(guān)[18,24],因此,總酚含量高說明火龍果汁涼茶飲料具有高的抗氧化活性。
火龍果中主要的抗氧化成分是甜菜色素和酚類物質(zhì),其中甜菜苷(Betanin, BN)可有效地清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基,且清除效果與甜菜苷的含量呈正相關(guān)[2,17]。如表6所示,各組的甜菜苷色素含量分別為(78.5±1.4)、(65.3±1.8)、(57.4±1.5)、(48.7±1.6)mg/L,其與總酚含量、對(duì)抗氧化能力指標(biāo)強(qiáng)弱順序均為試驗(yàn)組、控制組、對(duì)照組、空白組,并均具有顯著性差異(P<0.05);甜菜苷色素、總酚含量及4種抗氧化指標(biāo)的趨勢(shì)線皆符合量效關(guān)系,R2都在0.962 4~0.999 8范圍內(nèi),顯示中藥濃縮液可能含有某些生物活性因子以激發(fā)乳酸菌發(fā)酵的酶類生化反應(yīng)系統(tǒng),促進(jìn)多糖產(chǎn)量增加,從而穩(wěn)定并提升甜菜苷色素含量以增強(qiáng)抗氧化活性,此與文獻(xiàn)[17,26]研究的量效關(guān)系一致。利用中藥濃縮液促進(jìn)微生物發(fā)酵作用, 同時(shí)也表現(xiàn)抗氧化活性的加成作用,可大幅增強(qiáng)保健效果[1,16,19]。甜菜苷色素表現(xiàn)的抗氧化活性機(jī)理與含有鄰苯二酚基團(tuán)的色素成分有關(guān),酚基團(tuán)是良好的電子供體,是其發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵所在[2,26]。故經(jīng)中藥優(yōu)化的火龍果汁涼茶具有高抗氧化保健效果。
表6 各組的甜菜苷色素和總酚含量與抗氧化活性的關(guān)系
2.6.1 感官指標(biāo)
組織狀態(tài):質(zhì)地均勻細(xì)膩,無沉淀分層現(xiàn)象。口感滋味: 口感清新,酸甜爽口。發(fā)酵風(fēng)味: 發(fā)酵特征純正,果香清醇。外觀色澤: 色澤均勻,晶瑩清澈。
2.6.2 理化指標(biāo)
總糖含量:(14.1±1.2)%;總酸(以醋酸計(jì)):(1.32±0.11) mg/dL;pH(4.2±0.2)。
2.6.3 微生物指標(biāo)
菌落總數(shù):9 CFU/mL(<100 CFU/mL);大腸菌群:1個(gè)(<3個(gè)(MPN/100 mL));致病菌:未檢出。
利用中藥促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵火龍果汁與仙草汁,創(chuàng)新開發(fā)保健型火龍果汁涼茶飲料,使其具備活性乳酸菌發(fā)酵的仙草多糖與火龍果營(yíng)養(yǎng)、兼具中藥促進(jìn)抗氧化和保健養(yǎng)生等復(fù)合功能。最佳工藝和配方組合:糖添加量14%、中藥添加量3%、菌種添加量10%、檸檬汁添加量7%。該產(chǎn)品的DPPH自由基清除率(88.40±1.80)%、還原力(0.86±0.05)、亞鐵離子螯合力(73.7±2.3)%、亞油酸過氧化抑制作用(54.5±3.4)%、甜菜苷色素含量(78.5±1.4) mg/L、總酚含量(29.6±0.5) mg/g,說明火龍果汁涼茶飲料具有較高的抗氧化功能。中藥可促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵使火龍果汁涼茶飲料具有較好的保健效果,且火龍果甜菜苷色素和總酚含量與DPPH等抗氧化指標(biāo)具有正向的量效關(guān)系,故本研究開發(fā)的火龍果汁涼茶飲料可適應(yīng)現(xiàn)代休閑保健飲品的養(yǎng)生需求。