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    魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究

    2021-11-15 01:57:46劉昭華王可崔緒奎靳青朱榮生王建英孟憲鋒張冬梅譚秀文
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:肌管培養(yǎng)液消化

    劉昭華,王可*,崔緒奎,靳青,朱榮生,王建英,孟憲鋒,張冬梅,譚秀文

    (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100;

    2.山東省鄒城市畜牧業(yè)發(fā)展中心,山東 鄒城 273500)

    我國肉羊存欄量和羊肉產(chǎn)量均居世界首位,是名副其實(shí)的養(yǎng)羊大國。但是羊肉生產(chǎn)仍存在兩大問題:一是隨著我國國民經(jīng)濟(jì)和人民生活水平的不斷提高,羊肉需求量日益擴(kuò)大,羊肉產(chǎn)量很難滿足市場需求;二是我國肉羊飼養(yǎng)水平較低,市場供應(yīng)的羊肉品質(zhì)普遍不高,優(yōu)質(zhì)高檔肉甚少。眾所周知,肌肉組織的生長發(fā)育直接決定產(chǎn)肉量和肉質(zhì)。因此,對肉羊肌肉生長發(fā)育影響因素進(jìn)行研究,有利于提高肌肉沉積速度和肉質(zhì)等級,促進(jìn)我國肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

    細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究肌肉生長發(fā)育最有利的工具。這是因?yàn)榕c動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)相比,體外培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞遺傳背景、培養(yǎng)條件和活性狀態(tài)等都一致,所獲得的試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定、組內(nèi)數(shù)據(jù)差異較小,更具有說服力和參考價(jià)值[1-3]。然而目前關(guān)于肉羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究甚少,其生長規(guī)律并不清楚。不同于其他組織來源的體細(xì)胞,肌肉細(xì)胞只有分化后才能發(fā)揮生理功能,但目前關(guān)于肉羊肌肉細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究僅局限于驗(yàn)證其是否具有肌源性,而對支撐生理功能的超微結(jié)構(gòu)研究報(bào)道較少。因此,本研究建立魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,并對其生長規(guī)律、誘導(dǎo)分化以及超微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行探討,旨在為肌肉細(xì)胞研究提供生長和分化特性等方面的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 主要試劑 0.25%胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)液,購自美國Gibco公司;馬血清(HS)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、三抗混合液(青霉素、鏈霉素和兩性霉素),購自以色列BI公司;生肌決定因子(MyoD1)抗體、成肌調(diào)節(jié)因子(Myf5)抗體,購自北京Bioss公司;山羊抗兔IgG/FITC抗體,購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

    1.1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),倒置相差顯微鏡及全自動(dòng)顯微攝像裝置(日本Nikon公司),Moxi Z微型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國ORFLO公司),流氏細(xì)胞儀(美國BD公司),掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 肌肉細(xì)胞培養(yǎng) 將剛出生的魯西黑頭羊羔羊從養(yǎng)殖場立即送到無菌室的準(zhǔn)備間,窒息處死羔羊后剪開后腿內(nèi)側(cè)皮膚,剪下3~4塊1~2 cm3的肌肉組織,置于裝有PBS液(含2%三抗)的50 mL離心管中并放至超凈工作臺(tái)內(nèi)。用眼科鑷子將肌肉組織放在無菌塑料平皿上,PBS液(含2%三抗)清洗3~5次,將外圍組織去除,剩余組織繼續(xù)用PBS液清洗2~3遍后放在干燥的平皿上,剪碎約至1 mm3大小,加入0.25%胰酶(含0.05%EDTA)放置4℃冰箱過夜。第2 d放置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化1 h,加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化,用移液器輕輕吹打至組織塊基本消失,先過400目細(xì)胞篩,收集濾液再過200目細(xì)胞篩,之后收集濾液300×g離心5 min,收集細(xì)胞沉淀后再用細(xì)胞培養(yǎng)液離心洗滌1次,加入細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS+1%三抗)重懸接種到培養(yǎng)瓶內(nèi),于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

    1.2.2 肌源性鑒定 待細(xì)胞貼壁至80%~90%時(shí)棄掉培養(yǎng)液,加入0.25%胰酶(含0.05%EDTA),置于37℃培養(yǎng)箱消化處理3~5 min,待細(xì)胞徹底消化下來后加入培養(yǎng)液中和,300×g、5 min離心收集細(xì)胞,加入固定液室溫處理30 min,離心后棄上清液。加入含0.1%Trinton X-100的PBS液處理10 min,離心棄上清液,加入含3%BSA的PBS液處理2 h,之后加入一抗(MyoD1或Myf5)或?qū)φ誌gG,4℃孵育過夜。離心去除一抗,加入FITC連接的山羊抗兔IgG二抗,室溫避光孵育1 h。離心去上清液,將細(xì)胞重懸于200μL PBS液中,利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行MyoD1或Myf5表達(dá)檢測。

    1.2.3 生長曲線繪制 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到6孔培養(yǎng)板中,接種當(dāng)日記為0 d,接種第2日記為1 d。每天盲選1個(gè)培養(yǎng)板,棄掉培養(yǎng)液,每孔加入1 mL 0.25%胰酶(含0.05%EDTA),放置于37℃培養(yǎng)箱消化處理3~5 min,待細(xì)胞徹底消化下來后加入2 mL培養(yǎng)液中和,用移液器充分混勻后吸取75μL,加入到芯片進(jìn)液口處,Moxi Z微型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀立即讀數(shù)。剩余未處理的細(xì)胞隔天換液,直到試驗(yàn)結(jié)束。

    1.2.4 成肌誘導(dǎo) 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到T25培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)棄掉培養(yǎng)液,加入5 mL成肌誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM/F12+2%HS+1%三抗),放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),隔天換液。

    1.2.5 樣品處理及電鏡觀察 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到T75培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁90%~100%時(shí),用塑料細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下來,300×g、5 min離心收集細(xì)胞,加入電鏡固定液放置4℃冰箱保存。誘導(dǎo)分化肌肉細(xì)胞樣品的制備按成肌誘導(dǎo)處理,待形成肌管時(shí)收集細(xì)胞、固定保存。

    透射電鏡樣品處理主要包括:(1)瓊脂預(yù)包埋:將固定處理的細(xì)胞離心,棄上清加入PBS,混勻漂洗3 min后再離心,重復(fù)洗滌3次。提前加熱溶解制備1%瓊脂糖溶液,稍冷卻后加入1.5 mL離心管內(nèi),在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起懸浮包裹于瓊脂糖內(nèi)。(2)后固定:PBS配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h,PBS漂洗3次,每次15 min。(3)室溫脫水:樣品依次入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%酒精上行脫水,每次20 min,100%丙酮兩次,每次15 min。(4)滲透包埋:丙酮∶812包埋劑=1∶1于37℃處理2~4 h,丙酮∶812包埋劑=1∶2于37℃滲透過夜,純812包埋劑于37℃處理5~8 h。將純812包埋劑倒入包埋板,將樣品插入包埋板后37℃烤箱過夜。(5)聚合:包埋板放于60℃烤箱聚合48 h,取出樹脂塊備用。(6)超薄切片:樹脂塊于超薄切片機(jī)60~80 nm超薄切片,150目方華膜銅網(wǎng)撈片。(7)染色:銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min;70%酒精清洗3次;超純水清洗3次;2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min;超純水清洗3次,濾紙稍吸干。銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。(8)透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

    掃描電鏡樣品處理主要包括:(1)后固定:固定好的樣品經(jīng)PBS漂洗3次,每次15 min。PBS配制1%鋨酸室溫避光固定1~2 h。PBS漂洗3次,每次15 min。(2)脫水:樣品依次入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精各15 min,乙酸異戊酯15 min。(3)干燥:將樣品放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。(4)樣品導(dǎo)電處理:將樣品緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金30 s左右。(5)掃描電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肌肉細(xì)胞生長情況

    肌肉細(xì)胞接種培養(yǎng)后,經(jīng)過短暫的懸浮狀態(tài)然后貼壁擴(kuò)增,其形態(tài)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而發(fā)生改變(圖1)。第1 d(接種當(dāng)日記為0 d),細(xì)胞散在貼壁生長,呈不規(guī)則多角形;隨著細(xì)胞不斷分裂擴(kuò)增,生長空間逐漸減少,第3 d細(xì)胞呈長條形;第6 d開始零星出現(xiàn)分化的肌管,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,肌管越來越多;直到20 d左右,肌肉細(xì)胞全部分化為肌管;之后肌管開始聚集、隆起,最后形成團(tuán)狀類似肉糜的顆粒。

    圖1 不同培養(yǎng)天數(shù)肌肉細(xì)胞生長形態(tài)(100×)

    肌肉細(xì)胞在最初的1~2 d內(nèi)處于緩慢生長的潛伏期;從第3 d開始直到第6 d,細(xì)胞進(jìn)入快速生長的指數(shù)增長期;從第7 d開始直到第20 d左右,細(xì)胞生長達(dá)到飽和密度進(jìn)入平臺(tái)期;從第21 d開始,細(xì)胞數(shù)量逐漸降低,進(jìn)入衰退期(圖2)。

    圖2 肌肉細(xì)胞生長曲線

    2.2 肌源性鑒定

    利用流式細(xì)胞儀檢測肌肉細(xì)胞表達(dá)MyoD1和Myf5陽性率,結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),MyoD1和Myf5表達(dá)陽性率均在95%以上,說明培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞純度較高。

    圖3 肌肉細(xì)胞MyoD1和Myf5陽性率

    2.3 誘導(dǎo)分化

    細(xì)胞接種培養(yǎng)后,于第3 d完全貼滿培養(yǎng)瓶底壁,這時(shí)更換誘導(dǎo)分化液或正常換液(即為分化處理的第1 d),結(jié)果(表1、圖4)發(fā)現(xiàn),正常換液組出現(xiàn)肌管時(shí)間為分化處理的第4 d,肌管聚集時(shí)間為第19 d;誘導(dǎo)分化組出現(xiàn)肌管時(shí)間為分化處理的第2 d,肌管聚集時(shí)間為第5 d。說明自然狀態(tài)下肌肉細(xì)胞也能分化成肌管,但分化進(jìn)程較誘導(dǎo)分化慢。

    表1 肌肉細(xì)胞在自然或誘導(dǎo)下的分化進(jìn)程 (d)

    圖4 肌肉細(xì)胞在自然或誘導(dǎo)下的分化形態(tài)(100×)

    2.4 超微結(jié)構(gòu)

    肌肉細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后,其超微結(jié)構(gòu)如圖5、圖6所示。細(xì)胞呈扁平、不規(guī)則長條形,簇?fù)懑B壓在一起;細(xì)胞表面伸出絲足,質(zhì)膜分布有很多空隙孔。線粒體十分豐富,為橢圓形,內(nèi)嵴發(fā)達(dá)、致密;核膜完整,核內(nèi)有電子致密的核仁;核膜外側(cè)有數(shù)量較多的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),表面核糖體清晰可見;脂滴的電子密度均勻,大量糖原散在細(xì)胞質(zhì)中;肌原纖維束致密、排列規(guī)則;細(xì)胞間緊密連接明顯。

    圖5 肌肉細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)

    3 討論與結(jié)論

    魯西黑頭羊是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的綿羊新品種,因其具有早熟、多胎、生長發(fā)育快、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性,目前已成為山東省肉羊養(yǎng)殖的主推品種,也被新疆、黑龍江、青海、內(nèi)蒙古、河南等?。▍^(qū))引種推廣,取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。為了更好地研究和利用魯西黑頭羊優(yōu)良的肉質(zhì)特性,本研究構(gòu)建科學(xué)、高效的魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞培養(yǎng)體系,為后續(xù)進(jìn)行肉質(zhì)和生長速度研究提供有利工具。

    目前肌肉細(xì)胞培養(yǎng)主要采取兩種方法,即組織塊培養(yǎng)法[4]和酶消化法[5]。組織塊培養(yǎng)法直接在培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿內(nèi)接種剪碎的肌肉組織小塊,10~15 d后細(xì)胞從組織塊周圍游離生長出來,細(xì)胞密度不均勻,生長狀態(tài)不一致;酶消化法將剪碎的肌肉組織小塊進(jìn)一步加入蛋白酶消化處理成單個(gè)游離的細(xì)胞,加入培養(yǎng)液后培養(yǎng),第2 d有細(xì)胞散在貼壁生長,細(xì)胞分布均勻,生長狀態(tài)一致。因此,本研究利用0.25%胰酶(含0.05%EDTA)消化處理肌肉組織,放置4℃冰箱過夜;為獲得更好的消化效果,第2 d于37℃繼續(xù)消化1 h,這樣既讓胰酶充分浸入組織,又不會(huì)造成消化過度,提高細(xì)胞活性,利于貼壁生長。

    生長曲線是反映細(xì)胞增殖速度的重要指標(biāo),包括潛伏期、指數(shù)增長期、平臺(tái)期和衰退期四個(gè)階段。細(xì)胞接種后經(jīng)過短暫的懸浮狀態(tài),然后貼壁生長,不斷擴(kuò)增。在培養(yǎng)的最初幾天,肌肉細(xì)胞增殖速度相對較慢,處于潛伏期。潛伏期時(shí)間長短不定,1.5 d[6]、3 d[7]都有報(bào)道,本研究中潛伏期為2 d,這可能與接種的密度、提供的營養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境不同有關(guān)。之后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增殖期,這一時(shí)期細(xì)胞分裂速度最快,大量擴(kuò)增并擠壓生長空間,細(xì)胞由最初的不規(guī)則多角形變?yōu)殚L條形。指數(shù)增殖期維持4 d左右,與Wu等[7]報(bào)道的基本一致。由于細(xì)胞存在生長接觸抑制,在生長空間消耗殆盡的情況下,細(xì)胞不再增殖,這時(shí)處于平臺(tái)期。本研究中肌肉細(xì)胞平臺(tái)期持續(xù)13 d左右,與其他組織來源的細(xì)胞相比[8-10],處于平臺(tái)期的時(shí)間較長。這可能因?yàn)檫@一時(shí)期肌肉細(xì)胞雖然不再增殖,但在營養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下,細(xì)胞開始分化,與出現(xiàn)肌管的時(shí)間點(diǎn)一致。

    體外培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞在分化階段發(fā)揮其生理功能。細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制后不再增殖,但在營養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下能自發(fā)分化成肌管,但分化速度較慢。采用含有特定物質(zhì)的培養(yǎng)液對肌肉細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化能夠提高分化速度和效率。已有報(bào)道表明,不同物種的肌肉細(xì)胞進(jìn)行成肌誘導(dǎo)采用在培養(yǎng)液中添加2%馬血清[11,12],也有報(bào)道采用10%馬血清[13]。本研究采用在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加2%馬血清進(jìn)行成肌誘導(dǎo),取得了很好的分化效果。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)必須在肌肉細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制后進(jìn)行誘導(dǎo)分化,如果提前換入誘導(dǎo)分化液,2%馬血清不能滿足細(xì)胞繼續(xù)增殖的營養(yǎng)需要,就不會(huì)出現(xiàn)生長接觸抑制,也就不能進(jìn)行分化,這一結(jié)果與Wu等[7]的結(jié)果不一致。

    超微結(jié)構(gòu)是細(xì)胞發(fā)揮生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究利用掃描電鏡觀察到分化的肌肉細(xì)胞呈長條形,簇?fù)頂D壓在一起,與光鏡觀察到的結(jié)果一致。肌肉細(xì)胞在增殖階段由于存在生長接觸抑制,所以細(xì)胞都是單層擴(kuò)增直至貼滿;誘導(dǎo)分化后則突破這一限制,細(xì)胞聚集、隆起,最后形成團(tuán)狀結(jié)構(gòu),這與小鼠肌肉細(xì)胞[13]、牛肌肉細(xì)胞[14]誘導(dǎo)分化結(jié)果一致。肌肉細(xì)胞由于自身的運(yùn)動(dòng)屬性,肌原纖維非常發(fā)達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),大量肌原纖維成束存在,有的存在于質(zhì)膜附近,有的在胞漿里面。胞漿內(nèi)含有大量的糖原和脂肪滴,線粒體十分豐富,內(nèi)嵴致密、發(fā)達(dá),可為肌肉細(xì)胞活動(dòng)提供能量。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá),表面核糖體清晰可見,可進(jìn)行合成蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些細(xì)胞器正常、有序的運(yùn)行,能夠?yàn)榧∪饧?xì)胞生長和發(fā)揮功能提供有利保障。

    本研究利用酶消化法成功構(gòu)建魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞培養(yǎng)體系,首次報(bào)道肌肉細(xì)胞不同于其他組織來源細(xì)胞的生長規(guī)律,以及誘導(dǎo)分化后符合自身運(yùn)動(dòng)屬性特征的超微結(jié)構(gòu)。

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