農(nóng)桿?菌介導(dǎo)葡萄灰葡萄孢遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

李廷剛，鞏東營(yíng)

（1.山東省葡萄研究院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營(yíng)養(yǎng)研究所，山東 濟(jì)南 250100）

灰霉病是葡萄生長(zhǎng)及貯存期的重要病害，在我國(guó)主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所致［1］。灰葡萄孢在自然界中可侵染200多種植物，包括番茄、絲瓜、草莓、葡萄等［2］，多以菌核在植株或者病殘?bào)w上越冬，翌年通過(guò)分生孢子傳播［3］。灰葡萄孢在葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中可侵染植株嫩莖、葉片、花穗、果實(shí)等大部分地上組織，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，可造成減產(chǎn)60%以上；在葡萄貯藏期是第一大病原菌，一旦發(fā)生可造成葡萄果粒腐爛，影響貯藏品質(zhì)，造成嚴(yán)重?fù)p失［4］。灰葡萄孢寄主范圍廣、變異速度快、抵御不良環(huán)境能力強(qiáng)，因此防治極為困難。尋找灰葡萄孢致病基因、探索致病機(jī)制，可為灰霉病綜合防控奠定基礎(chǔ)。

遺傳轉(zhuǎn)化是研究病原菌致病基因功能的重要技術(shù)基礎(chǔ)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）是目前應(yīng)用較為廣泛的轉(zhuǎn)化技術(shù)［5］。農(nóng)桿菌可以侵染真菌細(xì)胞，利用所攜帶的Ti質(zhì)粒，將T-DNA區(qū)隨機(jī)整合到受體細(xì)胞的基因組中，轉(zhuǎn)化過(guò)程受到多種小分子多糖及酚類物質(zhì)等的雙重調(diào)節(jié)，其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）在該過(guò)程中起促進(jìn)作用［6］。ATMT技術(shù)因其轉(zhuǎn)化受體要求低、操作流程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化子單拷貝插入等優(yōu)勢(shì)，目前已在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、橡膠樹(shù)炭疽病菌（Colletotrichum musae）等多種病原真菌中得到廣泛應(yīng)用［7-10］。

目前，在灰葡萄孢遺傳轉(zhuǎn)化研究中，ATMT技術(shù)也得到了較好的應(yīng)用。陶嵐［11］利用ATMT技術(shù)構(gòu)建了草莓灰葡萄孢突變體庫(kù)，并從中篩選出463個(gè)致病力異常的轉(zhuǎn)化子。王璇等［12］通過(guò)篩選基于ATMT技術(shù)構(gòu)建的番茄灰葡萄孢突變體庫(kù)，得到分生孢子產(chǎn)生缺陷轉(zhuǎn)化子BCt78。范雷等［13］通過(guò)優(yōu)化月季灰葡萄孢RoseBc-3的ATMT體系，篩選獲得6類不同表型轉(zhuǎn)化子。沈衛(wèi)鋒等［14］利用ATMT技術(shù)成功獲得了綠色熒光蛋白重組灰葡萄孢。Zhang等［15］通過(guò)篩選番茄灰葡萄孢ATMT突變體庫(kù)，得到分生孢子產(chǎn)生缺陷轉(zhuǎn)化子BCG183，定位確定候選基因BcKMO，進(jìn)一步證明該基因可參與調(diào)控細(xì)胞壁降解酶活性、毒素活性和細(xì)胞壁完整性等。不同寄主灰葡萄孢具有其自身特異性，目前鮮有關(guān)于葡萄灰葡萄孢ATMT的相關(guān)研究。本試驗(yàn)以分離自葡萄的灰葡萄孢BcSD3菌株為材料，研究建立并優(yōu)化其ATMT體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄灰葡萄孢BcSD3菌株（高毒力菌株），于2020年7月分離自山東煙臺(tái)‘巨峰’葡萄灰霉病花穗。根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株、質(zhì)粒pBIG3C（含潮霉素抗性基因）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰葡萄孢分生孢子制備 將灰葡萄孢BcSD3菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，參照李廷剛等［16］報(bào)道的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢；使用滅菌水洗脫分生孢子，并用三層滅菌濾紙過(guò)濾去除菌絲等雜質(zhì)；離心收集分生孢子，并調(diào)節(jié)至適宜濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌菌液制備 采用熱擊法將pBIG3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中；篩選陽(yáng)性菌斑接種于LB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素）中，于28℃條件下?lián)u培2 d；離心收集菌體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600值等于0.15，繼續(xù)培養(yǎng)直至OD600值達(dá)到0.8。

1.2.3 灰葡萄孢對(duì)潮霉素B敏感性測(cè)定 制備分別含有5、10、25、50、100μg/mL潮霉素B的PDA平板，以不添加潮霉素B的PDA平板作為對(duì)照，用打孔器打取灰葡萄孢菌餅接種在PDA平板中心位置；于23℃光暗交替條件下培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，每個(gè)處理6個(gè)平板，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 農(nóng)桿菌對(duì)頭孢噻肟鈉敏感性測(cè)定 制備分別含有50、100、200、300、400μg/mL頭孢噻肟鈉的PDA平板，以不添加頭孢噻肟鈉的PDA平板作為對(duì)照，取已制備的OD600值為0.15的農(nóng)桿菌菌液均勻涂布于平板上；于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，每個(gè)處理6個(gè)平板，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 在含有不同濃度乙酰丁香酮（AS）的共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上平鋪一張玻璃紙，取100μL農(nóng)桿菌與灰葡萄孢分生孢子混合液均勻涂布于玻璃紙上，在不同溫度條件下共培養(yǎng)不同時(shí)間，后將玻璃紙轉(zhuǎn)移至新的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，覆蓋PDA培養(yǎng)基（內(nèi)含50μg/mL的潮霉素B和300μg/mL的頭孢噻肟鈉），在適宜溫度條件下光暗交替培養(yǎng)5 d，查看轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況。其中所用灰葡萄孢分生孢子濃度分別為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)/mL；所用AS濃度分別為100、200、300、400μmol/mL，以不添加AS培養(yǎng)基平板作為對(duì)照；共培養(yǎng)溫度分別為15、20、25、30、35℃；共培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72、96、120 h。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子檢測(cè)與鑒定 隨機(jī)選取8個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于不含抗生素的PDA平板上，待菌落生長(zhǎng)至平板3/4面積時(shí)，打取菌餅轉(zhuǎn)接至新的不含抗生素的PDA平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代。之后打取菌餅，接種至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板上，觀察菌落生長(zhǎng)情況，重復(fù)3次。使用CTAB法提取野生型灰葡萄孢和8個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，分別擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hph）基因的特異片段。對(duì)野生型灰葡萄孢和8個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進(jìn)行HindⅢ單酶切，酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；以hph基因的特異擴(kuò)增片段為模板，探針標(biāo)記與檢測(cè)方法具體試驗(yàn)步驟參照地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒（羅氏）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010及SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢對(duì)潮霉素B敏感性測(cè)定

不同濃度潮霉素B對(duì)灰葡萄孢抑制作用測(cè)定結(jié)果如圖1所示，接種灰葡萄孢3 d后，與對(duì)照相比，5、10、25μg/mL潮霉素B可對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但仍可以生長(zhǎng)；當(dāng)潮霉素B濃度達(dá)到50μg/mL時(shí)，則可以完全抑制灰葡萄孢菌絲的生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)選擇50 μg/mL潮霉素B作為轉(zhuǎn)化子的篩選濃度。

圖1 灰霉病菌在含有不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

2.2 根癌農(nóng)桿菌對(duì)頭孢噻肟鈉敏感性測(cè)定

不同濃度頭孢噻肟鈉對(duì)農(nóng)桿菌抑制作用如圖2所示，農(nóng)桿菌涂布后培養(yǎng)3 d，對(duì)照組農(nóng)桿菌遍布整個(gè)平板，隨著頭胞噻肟鈉濃度的不斷提高，存活農(nóng)桿菌菌落數(shù)不斷減少，抑制效果不斷增強(qiáng)；當(dāng)濃度增至300μg/mL時(shí)，可完全抑制其生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)選擇300μg/mL頭孢噻肟鈉作為轉(zhuǎn)化子的篩選濃度。

圖2 農(nóng)桿菌在含有不同濃度頭孢噻肟鈉的PDA平板上生長(zhǎng)情況

2.3 分生孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖3可知，隨分生孢子濃度的增加，每培養(yǎng)皿得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)量不斷增加。分生孢子濃度為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)/mL每培養(yǎng)皿分別平均得到3、9、14、31個(gè)和67個(gè)轉(zhuǎn)化子。基于試驗(yàn)操作和轉(zhuǎn)化子特異性綜合考慮，分生孢子濃度1×105個(gè)/mL為最適轉(zhuǎn)化濃度。

圖3 不同分生孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4 乙酰丁香酮濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

當(dāng)不添加AS時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)皿平均僅得到2個(gè)轉(zhuǎn)化子；隨著AS濃度不斷提高，轉(zhuǎn)化子數(shù)量不斷增加，濃度為200μmol/mL時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿平均可得到33個(gè)轉(zhuǎn)化子；之后，隨著AS濃度不斷增加轉(zhuǎn)化子數(shù)量不斷減少（圖4）。因此，AS濃度200μmol/mL為最佳轉(zhuǎn)化濃度。

圖4 不同乙酰丁香酮濃度對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

當(dāng)共培養(yǎng)溫度為15℃時(shí)，每培養(yǎng)皿平均可得到7個(gè)轉(zhuǎn)化子；隨著共培養(yǎng)溫度不斷升高轉(zhuǎn)化子數(shù)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，25℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，每培養(yǎng)皿平均可得到32個(gè)轉(zhuǎn)化子，當(dāng)共培養(yǎng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，每培養(yǎng)皿平均轉(zhuǎn)化子數(shù)量下降到11個(gè)（圖5）。因此，25℃為最佳共培養(yǎng)溫度。

圖5 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為24、48、72、96、120 h時(shí)，每皿分別平均可得到18、33、34、26個(gè)和22個(gè)轉(zhuǎn)化子；其中，共培養(yǎng)時(shí)間為48 h和72 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)，且無(wú)顯著差異（圖6）。共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子有多拷貝插入的比例越高，因此，48 h為最適共培養(yǎng)時(shí)間。

圖6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.7 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性檢測(cè)及分子鑒定

隨機(jī)選取8個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果顯示，在含有50μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基平板上所有轉(zhuǎn)化子均可正常生長(zhǎng)。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因特異片段擴(kuò)增結(jié)果如圖7a所示，灰葡萄孢野生型中無(wú)條帶，8個(gè)轉(zhuǎn)化子中均可擴(kuò)增到特異性條帶，且大小與對(duì)照相同。表明，TDNA片段已經(jīng)整合到灰葡萄孢基因組中，并且可以穩(wěn)定遺傳。

轉(zhuǎn)化子Southern blot檢測(cè)結(jié)果如圖7b所示，灰葡萄孢野生型中無(wú)任何條帶，8個(gè)轉(zhuǎn)化子均可得到特異性條帶，其中6個(gè)轉(zhuǎn)化子為單拷貝插入，2個(gè)轉(zhuǎn)化子為雙拷貝插入，單拷貝插入比例可達(dá)到75%。表明hph基因已經(jīng)整合到灰葡萄孢基因組中，且多以單拷貝形式插入。

圖7 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)及Southern blot分析

3 討論與結(jié)論

遺傳轉(zhuǎn)化是研究真菌基因功能的重要技術(shù)手段，常用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)包括PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化、限制酶介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化等［17-19］。ATMT技術(shù)因其無(wú)需制備原生質(zhì)體、單拷貝插入率高、操作流程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，在多種真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究中得到了較好的應(yīng)用［20，21］。但不同真菌間、甚至同一真菌不同種間的遺傳轉(zhuǎn)化條件存在較大差異，主要受共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS濃度、共培養(yǎng)液中分生孢子濃度、共培養(yǎng)溫度以及共培養(yǎng)時(shí)間等因素影響。本研究建立了葡萄灰葡萄孢ATMT體系，為開(kāi)展其基因功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

分生孢子濃度與轉(zhuǎn)化效率大致呈正相關(guān)趨勢(shì)，這主要是因?yàn)榉稚咦訚舛鹊奶岣咴黾恿宿r(nóng)桿菌侵染的概率，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。由于一個(gè)培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)化子過(guò)多會(huì)造成菌落相互覆蓋，不利于后期轉(zhuǎn)化子的分離純化，因此分生孢子應(yīng)選擇適宜濃度。AS對(duì)Ti質(zhì)粒上vir基因的活化起重要作用，因此在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中需加入適當(dāng)濃度的AS以提高轉(zhuǎn)化效率。本研究中AS最佳濃度為200μmol/mL，之后隨著濃度繼續(xù)提高，轉(zhuǎn)化效率逐漸下降。推測(cè)這可能是因?yàn)檫^(guò)高濃度的AS對(duì)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了毒害作用，抑或是抑制了Ti質(zhì)粒上的vir基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。

共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響呈正態(tài)分布趨勢(shì)，最佳共培養(yǎng)溫度為25℃，過(guò)低或者過(guò)高均會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。推測(cè)這可能是因?yàn)榛移咸焰叻稚咦泳哂凶约鹤钸m的生長(zhǎng)溫度；同時(shí)，Ti質(zhì)粒上vir基因的表達(dá)也較易受到溫度的影響。本研究中最適共培養(yǎng)時(shí)間為48 h，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌未能完成侵染，從而造成轉(zhuǎn)化效率不高；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。這或許是因?yàn)楣才囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子生活力衰弱，從而影響轉(zhuǎn)化效率。此外，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還易導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子中多拷貝插入的現(xiàn)象，為后續(xù)開(kāi)展基因功能研究帶來(lái)不便［22］。