氣相色譜-質(zhì)譜法測定藥用丁基橡膠塞中18種多環(huán)芳烴的含量

薄曉文， 張 敏， 郭利娟， 劉雪婷， 沈 永*

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院，山東濟(jì)南 250101；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質(zhì)量控制重點實驗室，山東濟(jì)南 250101；3.山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室，山東濟(jì)南 250101)

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)具有致癌、致畸和致突變等危害，并且具有生物難降解性和累積性[1]，因此，美國環(huán)境總署(EPA)把具有致癌、致畸和致突變的16種PAHs確定為重點控制污染物。歐盟發(fā)布的2005/69/EC指令，對填充油和輪胎中8種PAHs的含量進(jìn)行限制[2]。歐盟REACH法規(guī)附件X VII50也對消費品中的8種PAHs進(jìn)行了限制[3]。德國認(rèn)證技術(shù)文件ZEK 01.4-08[4]結(jié)合美國EPA及歐盟REACH法規(guī)管控的PAHs，將PAHs測試種類擴(kuò)大到了18種。

丁基橡膠塞因其良好的氣密性、低吸濕率、穩(wěn)定性、耐老化性和低析出性而被廣泛用于醫(yī)療器械生產(chǎn)和藥品包裝[5]。丁基橡膠塞在生產(chǎn)過程中需加入硫化劑、硫化促進(jìn)劑、硫化活性劑、補強(qiáng)劑、填充劑、軟化劑、防老劑、著色劑等多種加工助劑，以使橡膠基體獲得良好的加工性能和使用性能[6,7]，PAHs通常隨填充油(軟化劑)和炭黑(補強(qiáng)劑和著色劑)的使用而被引入其中[8]。丁基橡膠塞與藥品長期接觸，多環(huán)芳烴等有毒有害物質(zhì)可能會遷移進(jìn)入藥品，這不僅會影響藥品的質(zhì)量，還有可能對患者的健康造成威脅。因此，需建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法測定藥用丁基橡膠塞中多環(huán)芳烴的含量。

目前，針對橡膠類產(chǎn)品中PAHs的檢測主要包括氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)及高效液相色譜法(HPLC)[7,9 - 14]。但現(xiàn)有方法主要集中在15～17種PAHs的測定上，存在同分異構(gòu)體不能有效分離的缺點。另外，由于橡膠類產(chǎn)品添加劑種類繁多、成分復(fù)雜，若樣品浸提液不經(jīng)凈化，直接進(jìn)樣GC-MS分析會存在基質(zhì)干擾，影響PAHs的定性及定量，并且容易造成進(jìn)樣口、色譜柱、檢測器等污染，影響儀器的使用壽命[10]。本文采用超聲浸提法對藥用丁基橡膠塞中的PAHs進(jìn)行極限浸提，通過固相萃取柱對樣品浸提溶液進(jìn)行凈化，同時對浸提條件進(jìn)行了優(yōu)化。利用GC-MS法建立了藥用丁基橡膠塞中18種PAHs的分析方法，并對不同生產(chǎn)廠家的樣品中18種PAHs的含量進(jìn)行了測定。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，適用于藥用丁基橡膠塞中18種PAHs的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

7890A-5977B氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國，安捷倫公司)；Turbovap LV全自動氮吹濃縮儀(瑞典，Biotage公司)。PAH-MIP固相萃取柱(博納艾杰爾，規(guī)格1 g/6mL)；Strata?PAH固相萃取柱(飛諾美，規(guī)格750 mg/6mL)；Oasis?HLB固相萃取柱(沃特世，規(guī)格5cc，200 mg)；Oasis?HLB固相萃取柱(沃特世，規(guī)格6cc，200 mg)。

18種多環(huán)芳烴(表1)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(美國o2si公司，濃度：1 000 mg/L，溶劑為二氯甲烷)，萘-D8標(biāo)準(zhǔn)溶液(美國o2si公司，濃度：2 019 mg/L，溶劑為二氯甲烷)；蒽-D10標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司，批號：G1001140，純度：98.94%)；苝-D12標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司，純度：99.42%)。分別取內(nèi)標(biāo)萘-D8、蒽-D10和苝-D12適量，用二氯甲烷配制成濃度約為2 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：用二氯甲烷將18種PAHs標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用前精密吸取二氯甲烷1 mL，加入混合內(nèi)標(biāo)溶液20 μL、不同量的PAHs標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成濃度為1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、5 ng/mL、6 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(內(nèi)標(biāo)濃度約為40 ng/mL)。甲苯、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷及丙酮均為色譜純。

藥用丁基橡膠塞樣品均由企業(yè)提供。

1.2 樣品的超聲浸提

將橡膠塞樣品剪成粒徑為2 mm～3 mm的顆粒，稱取1 g(精確至0.0001 g)，置于20 mL頂空瓶中，加入5 mL正己烷-丙酮(體積比1∶1)，再精確加入混合內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，混勻，密閉。在60 ℃水浴下超聲1 h。待頂空瓶冷卻至室溫后，將浸提液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中。再向頂空瓶中加入5 mL正己烷-丙酮混合溶液，重復(fù)上述操作2次，將3次的浸提液合并至玻璃試管中，待凈化。

1.3 萃取溶液凈化

將浸提液于35 ℃水浴中氮吹至近干，用2 mL正己烷復(fù)溶，過固相萃取柱(預(yù)先依次用20 mL二氯甲烷和10 mL正己烷活化)，再用2 mL正己烷沖洗玻璃試管，重復(fù)操作兩次，將沖洗液過柱，棄去上述濾液。用10 mL二氯甲烷淋洗，收集淋洗液。將淋洗液在35 ℃水浴中氮吹濃縮至1 mL，渦旋振蕩混勻，如有必要過0.22μm有機(jī)濾膜，待測。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：DB-EUPAH色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；不分流；流速：1.4 mL/min；柱溫：60 ℃保持2 min，以25 ℃/min升溫至200 ℃，再以20 ℃/min升溫至320 ℃并保持24 min；傳輸線溫度：300 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源類型：電子轟擊離子源(EI)源；離子源溫度：230 ℃；MS四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：7.5 min；掃描方式：選擇離子模式(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11 - 13,15]，在采用GC-MS或GC-MS/MS法測定PAHs含量時，通常選用DB-EUPAH和HP-5MS這兩種色譜柱?？疾炝薍P-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和DB-EUPAH(60 m×0.250 mm×0.25 μm)兩種色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用HP-5MS色譜柱時，同分異構(gòu)體苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽和苯并(j)熒蒽無法完全分離，使用DB-EUPAH色譜柱時，在優(yōu)化后的色譜條件下，18種PAHs可以完全分離，色譜見圖1。萘-D8與萘、菲和蒽-D10在色譜圖中存在的峰重疊現(xiàn)象，可通過它們的定性、定量離子的不同來區(qū)分目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)。

圖1 PAHs和內(nèi)標(biāo)的選擇離子色譜圖Fig.1 Selected ion chromatograms of PAHs and internal standard compounds

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報道[1,9,10]，PAHs大多采用硅膠固相萃取柱進(jìn)行凈化，但董彩玉等[9]報道過柱液重現(xiàn)性較差。因此，我們實驗了市售固相萃取柱的凈化效果。發(fā)現(xiàn)其中兩家的固相萃取柱雖然對樣品浸提液有凈化作用，但對分子量較小的PAHs的回收率低。而博納艾杰爾的固相萃取柱不僅能對樣品浸提溶液起到凈化作用，降低背景干擾，還可確保目標(biāo)物在凈化過程中不損失。將樣品浸提液、正己烷上樣濾液和二氯甲烷淋洗液分別用二氯甲烷定容至10 mL，然后分別用全掃描模式(SCAN，掃描范圍m/z45～450)和SIM模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，樣品浸提溶液在用上述固相萃取柱凈化過程中，其中的雜質(zhì)在用正己烷上樣時會被保留在萃取柱中，但經(jīng)固相萃取柱凈化后，基質(zhì)干擾極大降低，不僅可避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，還有助于樣品中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量。

2.2.2 浸提溶劑的選擇參照相關(guān)文獻(xiàn)報道[7,9,10]，選用乙酸乙酯、正己烷、甲苯、正己烷-二氯甲烷(1∶1)、正己烷-乙酸乙酯(1∶1)、正己烷-丙酮(1∶1)6種常見的PAHs浸提溶劑，通過對1個陽性樣品進(jìn)行浸提，考察不同浸提溶劑的浸提能力。結(jié)果表明，樣品中含有苊、芴、菲、熒蒽以及芘，乙酸乙酯浸提的峰響應(yīng)值最大，記為100%，其次為正己烷-丙酮(1∶1)，其所得樣品溶液中5種目標(biāo)物的峰響應(yīng)相對值均在95%以上，與乙酸乙酯幾乎相同，其余4種溶劑對目標(biāo)物的浸提效果明顯比前述兩種溶劑差，目標(biāo)物的峰響應(yīng)相對值大部分在80%以下。考慮到正己烷-丙酮(1∶1)氮吹至近干耗時短、所需水浴溫度低，有利于提高樣品前處理效率，因此選擇正己烷-丙酮(1∶1)為浸提溶劑。

2.2.3 浸提比例的優(yōu)化采用正己烷-丙酮(1∶1)為浸提溶劑，按不同浸提比例，對1個陽性樣品進(jìn)行浸提。具體操作如下：稱取樣品1 g(精確至0.0001 g)，分別加入5 mL、10 mL、15 mL和20 mL正己烷-丙酮(1∶1)，密封，于60 ℃水浴中超聲1 h，得浸提液，按儀器條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果表明，樣品中含有苊、芴、菲、熒蒽以及芘，隨著浸提比例的增大，其響應(yīng)值有所增加，但增幅僅在10%左右，當(dāng)浸提溶劑體積為20 mL時，浸提出的多環(huán)芳烴的響應(yīng)值反而下降。綜合考慮，最終確定浸提比例為5 mL/g。

2.2.4 極限浸提考察稱取樣品1 g(精確至0.0001 g)，加入5 mL正己烷-丙酮(1∶1)，密封，于60 ℃水浴中超聲1 h，制得樣品浸提液。然后，再向上述樣品中加入5 mL正己烷-丙酮(1∶1)，重復(fù)上述操作直至達(dá)到極限浸提。結(jié)果表明，第二次浸提時各檢出的PAHs的峰面積約為首次浸提檢出量的30%，第三次浸提時各檢出的PAHs的峰面積約為首次浸提檢出量的10%。因此，選擇樣品超聲浸提3次，合并浸提液作為樣品浸提液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢出限和定量限取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，按信噪比(S/N)為3時的濃度為檢出限，S/N為10且具有良好精密度和準(zhǔn)確度的濃度為定量限。本方法18種PAHs的檢出限和定量限見表1。結(jié)果顯示，萘檢出限為4.0 ng/mL，定量限為10.0 ng/mL；二苯并(a,h)蒽檢出限和定量限均為10.0 ng/mL；其余PAHs的檢出限為0.2～1.0 ng/mL，定量限為1.0～2.0 ng/mL，表明方法檢出限良好，靈敏度高。

表1 18種PAHs和內(nèi)標(biāo)的保留時間、定量離子、定性離子、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)Table 1 Retention times,quantitative ions,qualitive ions,LODs and LOQs of 18 PAHs and internal standards(ISTDs)

(續(xù)表1)

2.3.2 線性和范圍采用內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果顯示，在1～10 ng/mL和10～200 ng/mL范圍內(nèi)，所有目標(biāo)物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.9992。

表2 PAHs的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations,linear ranges and correlation coefficients(r) of PAHs

2.3.3 精密度和回收率取濃度為1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在上述3個濃度水平進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗中，每個濃度水平做3個平行樣，結(jié)果見表3。18種PAHs的加標(biāo)回收率為76.63%～113.93%，RSD值為0.11%～6.86%。上述結(jié)果表明方法精密度和準(zhǔn)確度良好，能夠滿足分析要求。

表3 PAHs的精密度和加標(biāo)回收率(%)Table 3 Precisions and recoveries of PAHs(%)

2.4 藥用丁基膠塞樣品的檢測

表4 不同廠家生產(chǎn)的藥用丁基膠塞中18種PAHs 的含量(ng/g)Table 4 Contents of PAHs in pharmaceutical butyl rubber closures acquired from different producers (ng/g)

3 結(jié)論

本文建立了GC-MS法測定藥用丁基橡膠塞中18種PAHs含量。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，能夠有效降低膠塞樣品中的基質(zhì)干擾，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，適用于藥用丁基膠塞中18種PAHs含量的測定，為此類產(chǎn)品的安全評價和質(zhì)量控制提供了方法參考。