補腎解毒通絡方對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎大鼠TLR4/IκBα/NF-κB信號通路相關因子的影響

陳倩雯，何奕坤，沈佳瑩，楊光輝

1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蝕性關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性、自身免疫性疾病，其發(fā)病率在自身免疫性疾病中居首位，基本病理表現(xiàn)為滑膜炎癥、血管增生、滑膜增厚及滑膜纖維化改變，若不及時干預或治療不當，極易導致關節(jié)畸形、功能喪失，具有較高的致畸率和致殘率，嚴重者可伴發(fā)關節(jié)外系統(tǒng)受累，甚至有生命危險[1]。目前RA病因及發(fā)病機制尚未闡明，但普遍認為主要由免疫系統(tǒng)紊亂攻擊關節(jié)形成的慢性炎癥所致[2-3]。全身性免疫失衡伴隨滑膜和關節(jié)的局部炎癥浸潤貫穿RA的整個過程[4]。Toll樣受體（TLR）是炎癥信號轉導的門戶蛋白，其中TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的TLR受體家族的一員，可通過激活核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、核因子（NF）-κB信號通路介導RA的免疫炎癥反應，在RA病程進展中具有重要作用[5]。補腎解毒通絡方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院風濕免疫科治療RA的有效方劑，具有補腎助陽、解毒消腫、祛瘀通絡、通利關節(jié)功效[6]。前期研究表明，本方治療RA臨床療效顯著[7-9]，可明顯降低RA患者血清白細胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平，具有良好的抗炎作用[10]。本研究基于TLR4/IκBα/NF-κB通路觀察補腎解毒通絡方對膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）模型大鼠的影響，探討其抗炎作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠32只，體質量（180±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度（22±2）℃，相對濕度53%～57%，12 h光照，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（PZSHUTCM 190301010）。

1.2 藥物

補腎解毒通絡方（仙茅12 g，淫羊藿12 g，續(xù)斷15 g，腫節(jié)風30 g，青風藤15 g，忍冬藤30 g，赤芍9 g，莪術30 g，牡丹皮9 g，片姜黃15 g，全蝎3 g，烏梢蛇9 g，甘草6 g），飲片購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房，使用純水煎煮2次，合并濾液，濃縮成含原藥材1.95 g/mL，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜装钡势?，上海上藥信宜藥廠有限公司，批號036190703，蒸餾水配制成0.1 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原，北京博蕾德生物科技有限公司，貨號20022；不完全弗氏佐劑（IFA），北京博蕾德生物科技有限公司，貨號7002；TLR4兔多克隆抗體，武漢愛博泰克生物，貨號A0007；NF-κB p65、IκBα兔單克隆抗體，美國CST公司，貨號分別為8242、4812；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，美國Proteintech公司，貨號A0208；TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 ELISA試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司，貨號分別為MM-0190R1、MM-0175R1、MM-0195R1、MM-0180R1。離心機（北京離心機廠，型號LDZ5-2），組織勻漿器（上海凈信科技發(fā)展有限公司，型號JX-FSTPRP-24），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus，型號IX71），病理切片機（德國徠卡，型號RM2015），垂直式蛋白電泳槽（美國Bio-Rad公司，貨號165-8004），RT-PCR儀（美國ABI公司，型號7500），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號5200）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組、補腎解毒通絡方組，每組8只。除正常組外，其余各組均參照文獻[11]方法制備CIA大鼠模型。將2 mg/mL牛Ⅱ型膠原溶液和預冷的IFA等體積混合后勻漿器乳化，制成終濃度為1 mg/mL牛Ⅱ型膠原/IFA乳劑。分別在大鼠背部、左后足腳面注射0.2 mL牛Ⅱ型膠原/IFA乳劑，尾根部2 cm處注射0.1 mL牛Ⅱ型膠原/IFA乳劑進行首次免疫，誘導大鼠發(fā)生炎癥，造模當日記為第0日；7 d后以0.1 mL/只在大鼠尾根部3 cm處注射牛Ⅱ型膠原/IFA乳劑進行二次免疫。正常組在相同時間、相同部位注射等體積生理鹽水。造模第14日后開始給藥，按人與大鼠體表面積換算給藥劑量（按60 kg成人臨床等效劑量6倍），甲氨蝶呤組按照1 mg/kg灌胃，每周1次；補腎解毒通絡方組按照10 mL/kg灌胃，每日1次；正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)21 d。

2.2 取材

治療結束后以舒泰50（60 mg/kg）肌肉注射麻醉大鼠，腹主動脈采血后迅速離斷后肢，剝離膝關節(jié)處皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織，用手術刀分離關節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出一側膝關節(jié)滑膜組織，另一側用剪骨刀分離膝關節(jié)后立即置于4%多聚甲醛溶液中固定。同法取出大鼠雙側踝關節(jié)滑膜組織，迅速投入液氮中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 觀察指標

2.3.1 一般狀況

觀察大鼠毛色、飲食、精神狀態(tài)變化及關節(jié)腫脹情況，每隔7 d測量并記錄大鼠體質量。

2.3.2 關節(jié)炎指數(shù)

造模后依據(jù)大鼠關節(jié)腫大、變形、紅腫狀況，采用五級評分法[7]對大鼠關節(jié)炎癥進行判定。0分表示無關節(jié)炎；1分表示關節(jié)出現(xiàn)紅腫，癥狀輕微；2分表示中度紅腫；3分表示嚴重紅腫；4分表示關節(jié)嚴重腫脹并出現(xiàn)功能障礙。關節(jié)炎指數(shù)為4個關節(jié)炎癥評分之和，每個關節(jié)評分最高為4分，總分最高為16分。每隔7 d進行評估并記錄。

2.3.3 足趾厚度

造模后每隔7 d用游標卡尺測量并記錄大鼠左后足趾厚度，選取大鼠足趾中部位置，垂直方向進行測定，連續(xù)測量3次，取平均值。

2.3.4 血清炎癥因子

大鼠麻醉后腹主動脈采血，置于4 ℃冰箱靜置5 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，ELISA試劑盒檢測大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.4 Western blot檢測

每組隨機取4只大鼠膝關節(jié)滑膜組織，每個組織稱取20 mg，置于2 mL EP管，加入200 μL裂解液，勻漿5 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品；以每孔20 μg蛋白上樣，每個樣品設2個復孔，進行SDS-PAGE，先80 V電泳30 min，再調(diào)整為100 V電泳30 min；濕轉法100 V恒壓轉膜120 min；以5%脫脂牛奶置于搖床上封閉20 min；加入TLR4、NF-κB p65、IκBα一抗，4 ℃孵育過夜，PBS-T清洗3次；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG孵育2 h，PBS-T清洗3次；ECL發(fā)光液顯影，全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件計算蛋白灰度值。

2.5 RT-PCR檢測

每組隨機取4只大鼠膝關節(jié)滑膜組織，每個組織稱取50 mg，將滑膜組織研磨成粉末，加入Trizol，離心柱法提取滑膜組織總RNA，反轉錄為cDNA，進行RT-PCR，引物由上海生工公司合成。引物序列見表1。以ABI實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 HE染色

將大鼠膝關節(jié)標本置于4%多聚甲醛固定液中固定1周，用15%EDTA-Na2溶液脫鈣7周，徹底脫去鈣鹽后常規(guī)石蠟包埋，每個標本沿正中矢狀面切片（厚度5～7 μm），二甲苯脫蠟，HE染色，梯度乙醇脫水，封片，鏡下觀察膝關節(jié)滑膜組織病理變化。

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，服從正態(tài)分布用方差分析，不服從正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗，組間比較用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 補腎解毒通絡方對模型大鼠一般狀況的影響

正常組大鼠形體豐滿，活動靈敏，精神、飲食正常，毛發(fā)光亮；模型組大鼠形體消瘦，活動緩慢，關節(jié)腫脹，足趾皮膚發(fā)紅，以左后足趾關節(jié)為甚，后足拖地跛行，飲食減少，精神萎靡，毛發(fā)稀疏黯淡少光澤；甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠關節(jié)腫脹程度減輕，活動雖緩慢但無跛行，精神尚可，飲食增加，毛發(fā)略稀疏。造模前各組大鼠體質量無明顯差異；二次免疫后，各組大鼠體質量增長較為緩慢，造模第14日，與正常組比較，模型組及甲氨蝶呤組大鼠體質量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；造模第21、28、35日，與正常組比較，各組大鼠體質量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠造模不同時點體質量比較（±s，g）

表2 各組大鼠造模不同時點體質量比較（±s，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數(shù) 第0日 第7日 第14日 第21日 第28日 第35日正常組 8 201.97±7.51 211.06± 6.77 222.98±7.35 234.98±10.71 246.91±10.25 259.33±10.25模型組 8 196.27±8.89 202.73± 9.62 210.08±9.26* 220.36± 3.45* 225.81± 4.38** 232.25± 3.32**甲氨蝶呤組 8 198.96±9.46 206.31± 9.06 210.12±9.43* 216.05± 9.60** 220.88±12.81** 225.16±15.59**補腎解毒通絡方組 8 199.00±9.94 208.10±10.80 211.76±9.39 217.02± 9.65** 222.22± 9.96** 229.97± 8.84**

4.2 補腎解毒通絡方對模型大鼠關節(jié)炎指數(shù)的影響

造模第7日，與正常組比較，各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯升高（P＜0.01），二次免疫后，各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)顯著升高，并在造模第14日達到峰值；造模第28、35日，與模型組比較，甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；造模第35日，與甲氨蝶呤組比較，補腎解毒通絡方組大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠造模不同時點關節(jié)炎指數(shù)比較（±s，分）

表3 各組大鼠造模不同時點關節(jié)炎指數(shù)比較（±s，分）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) 第0日 第7日 第14日 第21日 第28日 第35日正常組 8 0 0 0 0 0 0模型組 8 0 5.62±0.91** 8.12±0.64** 7.87±0.35** 7.25±0.70** 6.75±0.46**甲氨蝶呤組 8 0 5.60±0.91** 8.00±0.53** 6.50±0.76## 3.62±0.74## 2.37±0.51##補腎解毒通絡方組 8 0 5.37±0.74** 7.88±0.64** 7.12±0.83 3.62±0.74## 1.62±0.51##△△

4.3 補腎解毒通絡方對模型大鼠足趾厚度的影響

造模第7日，與正常組比較，各組大鼠足趾明顯腫脹發(fā)紅，左后足趾厚度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），二次免疫后，各組大鼠左后足趾厚度顯著增加，并在造模第14日達到峰值；造模第28、35日，與模型組比較，甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠足趾腫脹明顯減輕，左后足趾厚度明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表4、圖1。

圖1 各組大鼠給藥前后左后足趾形態(tài)

表4 各組大鼠造模不同時點左后足趾厚度比較（±s，mm）

表4 各組大鼠造模不同時點左后足趾厚度比較（±s，mm）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 只數(shù) 第0日 第7日 第14日 第21日 第28日 第35日正常組 8 3.98±0.20 4.03±0.19 4.15±0.14 4.23±0.18 4.29±0.18 4.35±0.17模型組 8 3.94±0.19 6.28±0.56** 8.65±0.77** 8.43±0.49** 8.21±0.52** 7.63±0.55**甲氨蝶呤組 8 3.88±0.28 6.02±0.57** 8.80±0.95** 6.98±0.60## 6.01±6.01## 5.16±0.23##補腎解毒通絡方組 8 3.99±0.19 6.21±0.49** 8.50±1.01** 7.69±0.79 5.72±0.36## 5.00±0.15##

4.4 補腎解毒通絡方對模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量顯著增加，IL-10含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量顯著減少，IL-10含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與甲氨蝶呤組比較，補腎解毒通絡方組大鼠血清IL-8含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) IL-6 IL-8 TNF-α IL-10正常組 8 61.91± 2.27 52.47±1.32 62.11±4.08 68.96±5.91模型組 8 139.08± 8.98** 142.34±2.56** 164.41±4.31** 31.42±4.02**甲氨蝶呤組 8 76.50±10.47## 107.03±7.01## 81.17±4.75## 61.65±5.18##補腎解毒通絡方組 8 75.40± 9.42## 86.37±8.33##△△ 75.51±8.48## 67.49±6.47##

4.5 補腎解毒通絡方對模型大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達明顯升高，IκBα蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達明顯降低，IκBα蛋白表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表6、圖2。

表6 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達比較（±s）

表6 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) TLR4 NF-κB p65 IκBα正常組 4 0.38±0.05 0.60±0.14 1.91±0.31模型組 4 1.01±0.11** 1.63±0.34** 0.56±0.28**甲氨蝶呤組 4 0.35±0.09## 0.96±0.10## 0.94±0.08#補腎解毒通絡方組 4 0.32±0.13## 0.68±0.14## 0.92±0.11#

圖2 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白免疫印跡圖

4.6 補腎解毒通絡方對模型大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達明顯升高（P＜0.01），IκBα mRNA表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和補腎解毒通絡方組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），IκBα mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。見表7。

表7 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達比較（±s）

表7 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) TLR4 NF-κB p65 IκBα正常組 4 0.34±0.02 0.27±0.06 1.89±0.31模型組 4 1.08±0.18** 1.34±0.26** 0.53±0.07**甲氨蝶呤組 4 0.45±0.07## 0.86±0.13# 1.78±0.45##補腎解毒通絡方組 4 0.40±0.12## 0.67±0.33## 1.80±0.22##

4.7 補腎解毒通絡方對模型大鼠膝關節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠膝關節(jié)及周圍組織結構正常，無特殊病理改變，滑膜組織成纖維細胞排列整齊，滑膜無增生，滑膜血管分布正常，管壁光滑，關節(jié)腔中無炎性細胞浸潤；模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織增生，滑膜細胞排列紊亂，組織內(nèi)新生毛細血管增多，管壁粗糙，有較多淋巴細胞及單核細胞浸潤；甲氨蝶呤組大鼠膝關節(jié)滑膜組織局部輕度增生，血管增多，管壁粗糙增厚，可見少量淋巴細胞及單核細胞；補腎解毒通絡方組大鼠膝關節(jié)滑膜組織無明顯增生，血管無明顯增多，有少量淋巴細胞及單核細胞。見圖3。

圖3 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織形態(tài)（HE染色，bars＝100 μm）

5 討論

免疫機制的觸發(fā)是引發(fā)RA病變的主要原因，促炎性細胞因子的不斷釋放及炎癥信號通路的異常激活在這一機制中起關鍵作用[12-13]。已有研究表明，TLR4/IκBα/NF-κB信號通路與RA密切相關，其激活能啟動多個下游炎癥信號通路的級聯(lián)反應，促進炎癥因子IL-6、TNF-α等分泌，抑制抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，在RA炎癥、關節(jié)破壞及相關合并癥中起關鍵作用[14-15]。目前該通路下游2個炎癥因子TNF-α和IL-6已被作為RA臨床治療藥物靶標，可通過抑制全身免疫反應和局部關節(jié)滑膜組織炎癥延緩RA病情[13]。

RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，其病因常涉及風、寒、濕、熱等外淫邪氣與肝、脾、腎三臟。而“腎虛毒蘊絡阻”是導致RA發(fā)生的關鍵病機[6]。其中，腎虛是導致RA骨關節(jié)病變發(fā)生的根本原因，腎主骨生髓，腎虛則無以藏精、無以御邪，致骨與關節(jié)失榮失養(yǎng)，若此時恰逢風、寒、濕、熱等外淫邪氣入侵機體，則易演變發(fā)展為痹證。毒邪是RA發(fā)生的主要致病因素，致病勢纏綿反復，病性頑固，且極易侵犯人體其他臟腑，難以根治?！岸拘啊敝虏〔菁?、病情重、致病廣泛且極易與六淫邪氣相合，符合RA發(fā)病特點，與現(xiàn)代醫(yī)學所說的免疫炎癥反應過程極為相似。絡脈受損貫穿RA全病程，絡脈伏行于分肉之間，外接關節(jié)肌肉，內(nèi)連五臟六腑。RA初起病位在淺表脈絡，患者以項背拘攣、關節(jié)酸脹麻木為主要臨床表現(xiàn)，若病情遷延，日久不愈，血行不暢，阻滯于深層脈絡則會損筋傷骨，出現(xiàn)關節(jié)腫脹、屈伸不利甚至畸變，后期若侵犯臟腑深部脈絡，則極易出現(xiàn)肺、心包及腎絡的損傷。補腎解毒通絡方中以淫羊藿、仙茅、續(xù)斷為君，溫腎助陽、祛風除濕、強筋健骨，此以二仙湯為基礎溫補腎陽，強腎而不燥熱，益精而無凝滯；臣以腫節(jié)風、忍冬藤、青風藤解毒消腫，片姜黃、烏梢蛇、全蝎通絡止痛，其中蟲類藥物有穿透筋骨、通達經(jīng)絡、破瘀消堅之功；佐以活血藥物牡丹皮、赤芍祛瘀通絡，阻斷瘀毒形成，以松透病根，使絡脈通利，血行暢達。諸藥相配，腎虛得補，瘀毒得解，絡阻得通，關節(jié)得養(yǎng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎解毒通絡方能減少RA患者血清炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α含量[10]。本研究從TLR4/IκBα/NF-κB炎癥通路入手，探討補腎解毒通絡方對RA的治療作用及其機制，為深入研究其機制及中醫(yī)藥治療RA提供實驗依據(jù)。

TLR4是一種模式識別受體[16]，廣泛表達于上皮細胞、內(nèi)皮細胞及免疫細胞表面，可對不同病原相關分子模式進行識別、結合并引發(fā)一系列的信號轉導，在天然免疫及獲得性免疫中具有重要作用，與慢性炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病緊密相關[17-19]。RA發(fā)病觸發(fā)機體免疫反應，TLR4可識別并激活機體的免疫細胞，進行免疫應答并激發(fā)機體的抗微生物防御體系，促使炎癥介質及趨化因子釋放，同時啟動多個下游炎癥信號通路轉導[14-15]。NF-κB是經(jīng)典的TLR4下游炎癥信號轉錄因子，主要由2個亞單位p65和p50結合成二聚體或異二聚體，有明顯的促炎活性。在靜息狀態(tài)下，p65/p50二聚體與IκB抑制蛋白家族結合，形成一個穩(wěn)定的三聚體存在于細胞質中[20]。當受到細胞因子、有絲分裂原等細胞外信號刺激時，IκB從三聚體中解離出來，釋放p65/p50進行核移位，與基因上的κB位點進行特異性結合，從而啟動多種炎癥基因的表達[21]。IκBα是IκB家族中的一員，是NF-κB蛋白的主要抑制劑[22]，當細胞外刺激發(fā)生時，上游信號通路（通常是TLR4信號通路）的級聯(lián)反應首先激活IκB激酶復合物，使IκBα發(fā)生泛素化、磷酸化并降解，降解的IκBα從NF-κB中解離，使NF-κB的2個亞單位活化，并從細胞質轉移到細胞核（尤其是p65亞單位），與相應的炎癥基因結合，啟動炎性細胞因子轉錄，釋放IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子[23]。IL-10是細胞介導免疫反應的負調(diào)節(jié)物，能抑制前列腺素E2和促炎因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的產(chǎn)生。本研究結果顯示，補腎解毒通絡方治療后，大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA水平明顯降低，IκBα蛋白及mRNA水平升高，說明補腎解毒通絡方能顯著抑制TLR4/IκBα/NF-κB信號通路轉導，抑制促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α釋放，促進抗炎因子IL-10產(chǎn)生，減輕大鼠滑膜炎癥反應，進一步抑制大鼠關節(jié)組織損傷。

綜上所述，RA病情與TLR4/IκBα/NF-κB信號通路的激活有關，補腎解毒通絡方能抑制該通路的激活，抑制促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α釋放，促進抗炎因子IL-10產(chǎn)生，顯著改善RA炎癥反應。本實驗初步探討了補腎解毒通絡方干預RA的作用機制，但未考察不同劑量補腎解毒通絡方的作用效果，今后研究可進一步明確量效關系。

致謝：感謝上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎病研究所李東東博士為本實驗提供技術指導。