基于網絡藥理學及數據挖掘探討中藥調節(jié)細胞焦亡用藥規(guī)律

梁子成，陳泓秀，文璐，張振，郭垠梅，田莎，黃曉蒂

1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208

細胞焦亡是發(fā)生在炎性小體激活下游的細胞程序性死亡，是免疫反應的重要組成部分[1]。細胞焦亡可發(fā)生在巨噬細胞、神經細胞等諸多細胞，是神經系統、心血管系統等眾多系統疾病的重要病機[2]。此外，細胞焦亡與腫瘤的增殖、侵襲及轉移密切相關[3]。因此，積極探討細胞焦亡相關機制、探索干預方法并開發(fā)相關藥物已成為研究熱點之一。

近年來，中藥與細胞焦亡相關研究迅速增加，存在一定數量的中藥干預細胞焦亡研究報道[4-6]。然而，現有報道多針對不同領域，且多為中藥單體或單藥調節(jié)細胞焦亡的作用研究，未能體現中藥多種類、多靶點的作用特點。因此，系統研究細胞焦亡相關靶點、化合物及中藥作用的物質基礎和用藥規(guī)律存在必要性。網絡藥理學集藥理學、生物信息學等多學科優(yōu)勢于一體，可系統分析靶點、化合物及中藥的關聯性[7]。本研究采用網絡藥理學方法探討細胞焦亡相關靶點、化合物與中藥之間的關系，借助分子對接驗證靶點與化合物的結合能力，分析相關中藥的物質基礎和用藥規(guī)律，以期為中藥調節(jié)細胞焦亡的理論探討、臨床研究及藥物研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 靶點獲取及靶點機制分析

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、CTD（http://ctdbase.org/）、GenCLip 3（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）數據庫，以“Pyroptosis”為關鍵詞進行檢索，獲得細胞焦亡相關靶點。利用UniProt（https://www.uniprot.org/）、STRING（https://string-db.org/）數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，獲得靶點全稱。采用R3.6.3軟件對靶點進行GO分析和KEGG富集分析。

1.2 候選化合物篩選及靶點-化合物網絡構建

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）共納入502味中藥、13 729個化合物及相關的3 339個靶點，其中包含成藥類似性正相關的類藥性（drug likeness，DL）等信息[8]。以細胞焦亡相關靶點全稱為檢索詞，通過TCMSP獲取細胞焦亡相關化合物的名稱、DL、PubChem CID等信息，以DL≥0.18為條件進行篩選，獲得候選化合物。將潛在靶點、候選化合物導入Cytoscape3.8.0軟件構建靶點-化合物網絡，并利用其插件CytoNCA進行分析。

1.3 分子對接驗證

為驗證細胞焦亡相關靶點與候選化合物作用關系的結合度，根據靶點-化合物網絡分析結果，選取度值前3位的靶點與度值前5位的化合物進行分子對接。通過PDB數據庫（http://www1.rcsb.org/）以靶點蛋白全稱獲取蛋白質模型文件，通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以PubChem CID獲取小分子配體文件，經AutoDockTools處理后，使用AutoDock Vina進行分子對接，使用PyMOL軟件作圖及繪制氫鍵。

1.4 候選中藥獲取及靶點-化合物-中藥網絡構建

利用TCMSP收集含有候選化合物的中藥，并根據2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）[9]、《中藥學》[10]進行篩選得到候選中藥，利用中醫(yī)傳承輔助平臺V2.5進行中藥性味歸經分析，導入Cytoscape3.8.0軟件構建靶點-化合物-中藥網絡并進行相關分析。

2 結果

2.1 細胞焦亡相關靶點及候選化合物

通過數據庫檢索獲得細胞焦亡相關靶點139個，其中可通過TCMSP匹配到化合物的靶點34個，其中化合物DL≥0.18的相關靶點31個，將31個靶點定義為化合物作用于細胞焦亡的潛在靶點（見表1）。以潛在靶點名稱與“DL≥0.18”為條件，通過TCMSP檢索獲得化合物101個，將其定義為細胞焦亡相關候選化合物，其中度值≥6的化合物見表2。

表1 化合物作用于細胞焦亡的潛在靶點

表2 細胞焦亡相關候選化合物信息（度值≥6）

2.2 潛在靶點機制分析

潛在靶點GO富集分析結果顯示：生物過程（biological process，BP）主要參與脂多糖反應、對細菌來源分子的反應、I-κB激酶/NF-κB信號傳導，細胞組分（cellular component，CC）主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等相關，分子功能（molecular function，MF）主要集中在細胞因子受體結合、半胱氨酸型肽鏈內切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等。KEGG富集分析結果顯示，主要信號通路為NOD樣信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路，此外，可能與細胞凋亡、沙門菌感染、甲型流感、志賀菌等相關。見圖1。

圖1 化合物作用于細胞焦亡的潛在靶點機制分析

2.3 靶點-化合物網絡

將潛在靶點與候選化合物構建靶點-化合物網絡（見圖2），該網絡由132個節(jié)點與313條邊構成。網絡中，度值前3位的靶點為CASP3、TNF、BCL2，分別與50、39、37個化合物相關；度值前5位的化合物為槲皮素（quercetin）、染料木黃酮（genistein）、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、漆黃素（fisetin）、熊果酸（ursolic acid），分別與15、13、13、11、10個靶點相關。

圖2 細胞焦亡相關靶點-化合物網絡

2.4 分子對接結果

將高度值靶點CASP3、TNF、BCL2與高度值化合物槲皮素、染料木黃酮、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯、漆黃素、熊果酸進行分子對接，靶點CASP3、TNF、BCL2的PDB ID分別為1RE1、2AZ5、6O0p。結合能＜-5.0 kcal/mol表示靶點與化合物結合活性較好。對接結果顯示，各靶點與化合物的對接結合能均小于-6.0 kcal/mol，最低為-10.0 kcal/mol，最高為-6.3 kcal/mol。氫鍵數是評估靶點蛋白-分子配體結合能力的重要指標。對接結果顯示，CASP3與槲皮素、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯、漆黃素，TNF與表沒食子兒茶素沒食子酸酯均形成了5個氫鍵，表明其對接質量較好，見表3。依據結合能≤-7.5 kcal/mol及氫鍵數選擇部分對接結果進行展示，見圖3。

圖3 細胞焦亡靶點與化合物分子對接示意圖

表3 細胞焦亡相關高度值靶點與化合物分子對接結果

2.5 靶點-化合物-中藥網絡

通過TCMSP獲得101個候選化合物的相關中藥共423種，其中2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）及《中藥學》收錄373種，將其定義為候選中藥。以潛在靶點、候選化合物及候選中藥構建靶點-化合物-中藥網絡（見圖4），網絡中包含505個節(jié)點和1 742條邊。度值前4位的中藥為麻黃（70）、沙棘（70）、紅花（68）、連翹（68），靶點數前4位的中藥為沙棘（21）、杜仲（20）、女貞子（20）、枇杷葉（20），見圖5。

圖4 細胞焦亡相關靶點-化合物-中藥網絡

圖5 細胞焦亡相關靶點-化合物-中藥網絡高度值和靶點數中藥（前18位）

2.6 中藥性味歸經

應用中醫(yī)傳承輔助平臺V2.5對373種候選中藥進行性味歸經分析，并依據2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）及《中藥學》進行核對。結果以寒性（38.61%）、苦味（36.68%）及入肝經（21.48%）、肺經（16.78%）藥物居多，見表4、表5、圖6。

圖6 調節(jié)細胞焦亡候選中藥歸經分析

表4 調節(jié)細胞焦亡候選中藥藥性分布

表5 調節(jié)細胞焦亡候選中藥藥味分布

3 討論

有別于脹亡、自噬等細胞死亡方式，細胞焦亡表現為細胞表面形成孔洞，細胞膜破裂、胞內容物外漏等引發(fā)炎癥反應[11-12]。細胞表面孔洞是由于GSDMD受到CASP3的特異性切割，其N末端生成的切片通過胞膜時形成，而CASP3激活又與腫瘤壞死因子（TNF）誘導作用有關[13-14]。細胞焦亡的發(fā)生和表現形式與肝、腎疾病[15-16]及腦損傷[17]、糖尿病[18]等發(fā)生發(fā)展相關。因此，對細胞焦亡相關靶點的機制進行系統研究，可為相關疾病研究提供理論參考。

對細胞焦亡潛在靶點的GO富集分析結果顯示，潛在靶點參與的生物過程主要為脂多糖反應、對細菌來源分子的反應、I-κB激酶/NF-κB信號傳導等。有研究發(fā)現，抑制脂多糖可通過非經典途徑抑制細胞焦亡發(fā)生，其機制是外膜囊和冠苷基結合蛋白介導脂多糖直接與胞內Caspases家族受體結合，脂多糖可誘導Caspases激活，進而導致GSDMD發(fā)生裂解[19-20]，而病原體和危險相關分子模式可與胞膜上Toll樣受體共同影響核因子-κB（NF-κB），觸發(fā)炎性小體轉錄，炎性小體可介導焦亡發(fā)生[21]。潛在靶點主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細胞組分相關，提示細胞焦亡形成過程中，孔洞形成位置可能與潛在靶點作用相關。潛在靶點的分子功能主要集中在細胞因子受體結合、半胱氨酸型肽鏈內切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等，顯示潛在靶點主要與半胱氨酸的活性反應相關，而Caspases家族炎性蛋白酶的活性在焦亡發(fā)生過程中起決定性作用[22]。KEGG富集分析結果顯示，細胞焦亡潛在靶點的主要相關信號通路為NOD樣信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路等。研究發(fā)現，抑制NOD受體家族成員NLRP3的活化，可有效減少GSDMD N末端切片的生成，進而抑制細胞焦亡的發(fā)生[23]。Hu等[24]使用馬錢子苷抑制NF-κB信號通路，可有效降低軟骨基質分解代謝，抑制關節(jié)軟骨的軟骨細胞焦亡。Tavakoli等[25]發(fā)現，胚胎干細胞來源的外來體可抑制Toll樣受體信號通路相關的TLR4介導的細胞焦亡。TNF-α是TNF信號通路的關鍵節(jié)點。Pei等[26]發(fā)現，TNF-α是三氧化二砷誘導細胞發(fā)生焦亡的關鍵靶點，并通過細胞實驗表明，抑制TNF-α產生可有效減少焦亡的發(fā)生。KEGG富集分析結果提示，細胞焦亡可能與一些疾病和病理過程的發(fā)生存在關聯性，如沙門菌、甲型流感病毒、志賀菌感染。沙門菌的致病性分泌系統與鞭毛可調節(jié)巨噬細胞焦亡，甲型流感病毒感染通過Ⅰ型干擾素信號通路引起呼吸上皮細胞發(fā)生焦亡，志賀菌可通過效應蛋白IpaB及其離子通道活性誘導巨噬細胞焦亡，從而對宿主感染產生保護性炎癥反應[27-29]。綜上可見，潛在靶點通過諸多機制參與調控細胞焦亡，富集分析的部分結果已在現有研究中得到較好的證實。同時，富集分析發(fā)現存在尚未報道的機制，可為后續(xù)相關領域研究提供參考，如焦亡發(fā)生的細胞多泡體定位、百日咳與細胞焦亡的關系等。

靶點-化合物網絡、靶點-化合物-中藥網絡可直觀體現中藥的多種類、多成分、多靶點作用特點。CASP3是細胞焦亡的介導因子，在調節(jié)GSDMD裂解作用中起關鍵作用，CASP3缺失可導致免疫系統發(fā)生改變，引發(fā)組織器官發(fā)生損害[30]。TNF-α表達增加可促進焦亡的發(fā)生，而BCL2可減弱D275處CASP1、4、5對GSDMD的裂解，增強D87處GSDMD的裂解，兩者均對細胞焦亡的發(fā)生具有調節(jié)作用[31-32]。本研究結果顯示，多個化合物可與多個靶點發(fā)生相互作用，尤以槲皮素關聯最多。研究發(fā)現，槲皮素可有效清除H2O2和HOCl，降低IL-1β水平，調節(jié)細胞焦亡的發(fā)生[33]。分子對接結果提示，靶蛋白與小分子配體結合能力較好，驗證了靶點-化合物互動的可靠性，可為細胞焦亡相關的新藥開發(fā)提供思路。

本研究發(fā)現，與細胞焦亡相關的中藥主要有麻黃、沙棘、敗醬草、杜仲、女貞子、金銀花、半枝蓮、木蝴蝶、白果等。麻黃、敗醬草、杜仲、女貞子、金銀花等所含山柰酚可通過抑制CASP1的表達和活性，增加TLR4、NLRP3的表達，抑制GSDMD分解，發(fā)揮抑制焦亡發(fā)生的作用[34-35]。燈盞花乙素為半枝蓮有效成分，可調節(jié)CASP1活化及成熟IL-1β、HMGB1的釋放，降低NLRP3的激活率，抑制焦亡發(fā)生[36-37]。木蝴蝶所含大黃素可通過TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路減輕心肌細胞損傷，抑制心肌細胞焦亡[38]。其余中藥尚未見細胞焦亡相關報道，但有研究顯示其有效成分或提取物存在干預炎性小體激活的作用[39-41]，有待進一步研究。

現有細胞焦亡相關中藥研究多為單藥或單藥成分的動物實驗和細胞實驗，缺少相對全面系統的分析。本研究基于細胞焦亡相關中藥的性味歸經分析用藥規(guī)律，可較好體現中藥調節(jié)細胞焦亡的內在規(guī)律。細胞焦亡是一種炎性細胞死亡方式，以調控炎性小體來實現，而體內炎性因子聚集處多發(fā)生炎癥發(fā)熱反應，與中醫(yī)“火毒”致病的認識相符?；鸲舅壑幎喑霈F發(fā)熱、紅腫等體征，用藥以苦寒為主，輔以辛溫，以防傷正。本研究結果顯示，細胞焦亡相關中藥以寒性、苦味最多，辛溫等為輔，體現了中醫(yī)“太過與不及”理論[42]。細胞焦亡相關中藥多入肝經、肺經。肝主藏血、主疏泄，焦亡發(fā)生依賴于炎性因子的調控，炎性因子的產生和發(fā)揮作用離不開血液濡養(yǎng)與運行；而疏泄功能與炎性因子的代謝相關，可調控體內炎性因子的分布。肺主一身之氣，協調全身氣機運行，氣機失常則痰濕內生，痰濕蘊久可內生火毒，同時痰濕也與焦亡的發(fā)生密切相關[43-44]。由此可見，中藥調控細胞焦亡應注重對“火毒”的辨證施治，用藥以苦寒清熱解毒為主，輔以辛溫，同時應注重維持肝的藏血與疏泄功能、協調肺等諸臟功能。

本研究雖聯合多個數據庫獲得較為全面的細胞焦亡相關靶點，但因數據庫信息更新等因素，可能導致化合物和中藥收集不全。此外，本研究分析了靶點、化合物、中藥之間的關系及其頻次，但未考慮量效關系等實驗和臨床實際因素，所得結果有待進一步驗證。