激光輔助孵化對凍融雙胚胎移植后胚胎存活及雙胎子代發(fā)育的影響

金珍　徐維?！窍沱悺垘X　夏美　李施施　張琳　吳麗梅　舒靜

[關(guān)鍵詞] 子代發(fā)育;體外受精;凍融胚胎移植;激光輔助孵化

[中圖分類號] R321.3? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）23-0096-05

Effects of laser-assisted hatching on embryo survival and twin progeny development after freeze-thaw double embryo transfer

JIN Zhen? ?XU Weihai? ?WU Xiangli? ?ZHANG Ling? ?XIA Mei? ?LI Shishi? ?ZHANG Lin? ?WU Limei? ?SHU Jing

Department of Reproductive Endocrinology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou? ?310014， China

[Abstract] Objective To evaluate the effects of LAH on embryo survival and neonatal and infant development by analyzing the embryo survival， twin neonatal development and 1-year-old infant development after double embryo transfer at？D3？cleavage of freeze-thaw from laser-assisted incubation（LAH）. Methods A total of 843 infertility patients with double embryo transfer who were admitted to Zhejiang Provincial People's Hospital from January 2017 to December 2019 were selected and divided into the LAH group（n=381） and the non-LAH group（n=462） according to the need for laser-assisted incubation（LAH） before transplantation. LAH treatment was used before transplantation in the LAH group， while no LAH treatment was used before transplantation in the non-LAH group. The pregnancy outcomes of the two groups were compared， and 156 patients with twin embryo survival（including 65 patients in the LAH group and 91 patients in the non-LAH group） were selected for the twin progeny growth and development indicators， including the gestational age at birth， weight， malformation， height and weight at the first year of life， etc.， to analyze the long-term effects of LAH on the development of embryos and infants. Results No significant difference was observed in the embryo survival rate between the LAH group and the non-LAH group（P>0.05）. No significant differences were observed in the birth weight of A， birth weight of B and the proportion of congenital malformation between the LAH group and the non-LAH group（P>0.05）. No abnormalities were observed in height， weight， cognition， teething and motor ability of twins in the two groups at the age of 1， and the differences were not statistically significant（P>0.05）. Conclusion The application of LAH has no significant influence on the embryo survival rate， the development of twin babies and the development of infants at the age of 1 after the freeze-thaw double embryo transfer. The influence of LAH on the deformities rate of twin babies is still needed to be studied in more cases.

[Key words] Progeny development; In vitro fertilization; Freeze-thaw embryo transfer; Laser-assisted hatching

體外受精-胚胎移植（In vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是不孕不育患者的主要助孕方法之一。胚胎著床是IVF-ET的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分為囊胚的孵化、定位、黏附和侵入四個環(huán)節(jié)，囊胚的成功孵化是胚胎植入的重要前提。在輔助生殖治療過程中，使用促排卵藥物、胚胎體外培養(yǎng)及冷凍-復(fù)蘇過程等均可導(dǎo)致透明帶硬化或增厚，引起囊胚孵化失敗而不能著床[1]。對于處于凍融胚胎移植（Frozen thawed embyo transfer，F(xiàn)ET）周期的患者，為了囊胚孵化率和胚胎種植率的提升，通常可對早期胚胎行透明帶削薄或打孔輔助孵化（Assisted hatching，AH）[2]，操作的方法包括機械法、酶消化法、化學(xué)法、激光輔助孵化（Laser-assisted hatching，LAH）等[3]。20世紀(jì)90年代早期， 激光打孔和激光薄化等非接觸性激光脈沖對胚胎透明帶的輔助孵化處理已開始應(yīng)用。與其他輔助孵化技術(shù)相比，激光法可更有效提高孵化率，且安全和方便，是最常用的輔助孵化技術(shù)之一[4]。LAH常用1480 nm的遠(yuǎn)紅外波長，遠(yuǎn)離核酸的吸收峰260 nm，避免對DNA造成損傷[5]。然而由于LAH采用高能量操作，其安全性是長期備受關(guān)注的問題。另外，經(jīng)LAH作用的囊胚孵出與自然狀態(tài)下的囊胚孵出的機制也有較大的差異[6]，其對于出生后代的影響鮮有報道。目前少數(shù)已有的研究認(rèn)為，LAH對單胚胎移植的妊娠結(jié)局及出生后1年內(nèi)子代發(fā)育無明顯影響[7]，但對于孕期潛在風(fēng)險更高的雙胚胎移植還未有報道。在試管嬰兒助孕過程中，部分醫(yī)師或患者在胚胎移植過程中為提高妊娠率而選擇雙胚胎移植，使多胎妊娠率上升，同時也造成新生兒早產(chǎn)、低出生體重等健康風(fēng)險的增加，而此時LAH對于胚胎發(fā)育及新生兒的潛在影響可能會更容易顯示出來。為探討LAH對于凍融雙胚胎移植后胚胎存活率及雙胎子代發(fā)育的影響，本研究收集843例D3雙胎胚移植的患者，并對胚胎存活情況及156例雙胎分娩的子代出生時及出生后1年的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對LAH在輔助生殖治療中使用的安全性進行詳細(xì)評估，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年12月在浙江省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受D3雙胚胎移植的843例及妊娠結(jié)局為雙胎分娩的156例FET周期資料，回顧性分析LAH操作對雙胚胎移植后胚胎存活及雙胎新生兒和后續(xù)嬰幼兒生長發(fā)育的影響。根據(jù)是否對移植前的胚胎行輔助孵化操作，將研究對象分為兩組，LAH組381例，胚胎復(fù)蘇后行LAH后進行雙胚胎移植;非LAH組462例，胚胎復(fù)蘇后未行LAH，直接行雙胚胎移植。另外，妊娠結(jié)局為雙胎分娩的研究對象共156例，也分為兩組，LAH組65例，非LAH組91例。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行 IVF-ET治療并成功臨床妊娠;②胚胎移植數(shù)目為2個;③有IVF-ET治療的詳細(xì)信息、妊娠結(jié)局及嬰兒生長發(fā)育情況記錄[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胚胎移植數(shù)量為1個或>2個;②IVF-ET治療的詳細(xì)信息、妊娠結(jié)局記錄或嬰兒生長發(fā)育情況記錄不詳;③行IVF-ET但未能成功臨床妊娠[8]。

1.2方法

1.2.1? 胚胎復(fù)蘇、LAH及胚胎移植? 胚胎玻璃化冷凍和復(fù)蘇的操作均在37℃環(huán)境下進行，冷凍及復(fù)蘇操作均按照Vitrolife公司的玻璃化冷凍及復(fù)蘇試劑盒的說明書進行。胚胎復(fù)蘇后在倒置顯微鏡下進行LAH（Octax Laser Shot System，Vitrolife，Germany）操作，該激光參數(shù)為：近紅外二極管波長1480 nm，聚焦能量150 J，激光脈沖長度2.6 ms。操作部位選擇胚胎與透明帶間隙最寬處。依次發(fā)射激光（激光能量）削薄但不穿透胚胎透明帶，削薄區(qū)域為透明帶全長的1/4，削薄深度為透明帶厚度的60%～80%。操作完成后將胚胎放置于37℃、5%O2、6%CO2及飽和濕度環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)直至移植。

1.2.2 隨訪? 由專業(yè)隨訪護士以電話問卷調(diào)查形式進行。隨訪項目包括新生兒出生時患者的孕齡、新生兒出生體重及出生缺陷等，生長發(fā)育的隨訪于出生1周年后進行，隨訪后代生長至1周歲為止的情況，包括身高及體重數(shù)據(jù)、出牙數(shù)目及出牙時間、運動能力、智力水平的評估。該隨訪表的Cronbach′s α系數(shù)值為 0.884>0.7，提示該隨訪的信度較好。問卷回收率為100%。

1.2.3 新生兒、嬰幼兒體格生長發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)? 新生兒出生體重<2500 g為低體重兒，孕周不足37齡為早產(chǎn)。周歲嬰幼兒發(fā)育情況如身高、體重的評估以《中國7歲以下兒童生長發(fā)育參照標(biāo)準(zhǔn)》為參照[9]，周歲男童正常身高范圍為68.6～85.0 cm，周歲女童為67.2～83.4 cm，低于該范圍者為身高發(fā)育遲緩，高于該范圍者為身高偏高;周歲男童正常體重范圍為7.21～12.54 kg;周歲女童為6.87～11.73 kg，低于該范圍者為體重偏輕，高于該范圍者為體重偏重。周歲嬰幼兒正常乳牙萌出數(shù)量4～6顆[10]，周歲乳牙未萌出者為乳牙遲萌。運動及心智根據(jù)WHO 0～6歲兒童體格發(fā)育評估參考標(biāo)準(zhǔn)進行評估[11]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布者經(jīng)過變量轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計學(xué)分析;計數(shù)資料結(jié)果以[n（%）]顯示，組間比較采用Pearson χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全部研究對象及妊娠結(jié)局為雙胎分娩研究對象的臨床基礎(chǔ)資料比較

本研究共納入843例研究對象，其中LAH組381例，非LAH組462例。LAH組女方年齡（32.13±3.41）歲，與非LAH組（31.55±3.11）歲比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組間不孕類型、不孕年限、不孕指征及受精方案比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。另外，本研究妊娠結(jié)局為雙胎分娩的研究對象共156例，其中LAH組65例，非LAH組91例。 LAH組女方年齡（31.63±4.19）歲，與非LAH組（30.35±3.51）歲比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組間不孕類型、不孕年限、不孕指征及受精方案比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2兩組胚胎存活情況比較

雙胚胎移植后妊娠的兩組患者共843例作為研究對象，統(tǒng)計對比兩組移植后妊娠結(jié)局。LAH組與非LAH組患者活胎數(shù)為0個的比例分別為30.97%和28.57%，活胎數(shù)為1個分別為51.97%和51.73%，活胎數(shù)為2個的比例分別為17.06%和19.70%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3 兩組雙胎新生兒出生時參數(shù)比較

雙胚胎移植后妊娠結(jié)局為雙活胎的兩組患者共156例作為研究對象，統(tǒng)計對比兩組間新生兒（共312例）出生時的參數(shù)。兩組患者早產(chǎn)率、A胎新生兒（共156例）出生體重、B胎新生兒（共156例）及總體新生兒（共312例）出生體重、低體重兒比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。LAH組雙活胎出生孕齡為（36.55±1.48）周，長于非LAH組的（35.89±2.17）周，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。LAH組共有2例新生兒畸形，分屬兩組患者雙胎后代之一，1例為先天性喉結(jié)缺如，1例為心臟房間隔缺損，畸形率為1.54%，而非LAH組出生1例畸形新生兒，為室間隔缺損，畸形率為0.55%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但均低于國內(nèi)多中心研究報告的出生缺陷發(fā)生率（5.6%）。見表4。

2.4 兩組雙胎嬰幼兒周歲參數(shù)比較

雙胚胎移植后妊娠結(jié)局為雙活胎的兩組新生兒共312例作為研究對象，統(tǒng)計對比兩組間雙胎嬰幼兒周歲時的參數(shù)。雙胎嬰幼兒周歲體重均無異常，LAH組周歲身高無異常，非LAH組有2例身高發(fā)育遲緩（1.10%）。所有隨訪者的體重、運動能力、出牙情況、智力評估均未見異常。見表5。

3討論

透明帶是包繞在哺乳動物卵子或早期胚胎周圍由糖蛋白構(gòu)成的膜狀物質(zhì)，在精卵識別和早期胚胎發(fā)育中起重要的作用。有研究提示，長時間的體外培養(yǎng)及胚胎的冷凍復(fù)蘇等操作可使得透明帶硬化，影響后續(xù)囊胚的孵化，造成著床失敗，是FET周期失敗的主要原因之一。

多項研究顯示，采用LAH對胚胎進行移植前透明帶消融，可以提高治療周期的胚胎著床率和臨床妊娠率[12]，目前已經(jīng)是FET周期的常規(guī)備選方案。由于LAH的熱效應(yīng)存在胚胎損傷的潛在風(fēng)險，其安全性仍有爭議[5]。本研究曾對FET周期中使用LAH后單胚胎移植并成功妊娠的患者進行新生兒和1歲齡嬰幼兒的生長發(fā)育狀況進行研究，結(jié)果顯示LAH后單胚胎移植后單胎新生兒及1歲齡嬰幼兒的發(fā)育狀況良好，與非LAH移植的患者并無明顯差異，初步表明LAH在FET中常規(guī)使用的安全性。而LAH對雙胚胎移植后雙胎妊娠并活產(chǎn)嬰幼兒的影響還鮮有報道。

有研究顯示，在試管嬰兒助孕患者雙胚胎移植后，其分娩雙活胎的比例達到24.07%，分娩單活胎的比例為58.98%，無活胎比例則為16.96%，活胎率明顯高于單胚胎移植[12-14]，表明與單胚胎移植相比，雙胚胎移植的患者能夠順利生產(chǎn)至少1個活產(chǎn)胎兒的概率明顯提高。但與此同時，雙胚胎移植引起不良妊娠結(jié)局的比例也明顯高于單胚胎移植[15-17]。與單胚胎移植7.64%的早產(chǎn)率相比，雙胚胎移植患者分娩新生兒早產(chǎn)的比例增至17.64%，且顯著高于國家衛(wèi)生健康委婦幼司報告的數(shù)據(jù)（約7%）[8]。同時，雙胚胎移植出生嬰兒低出生體重的比例也高于國家衛(wèi)生健康委婦幼司“低出生體重發(fā)生率控制在4%以下”的要求。單胚胎移植患者分娩的新生兒早產(chǎn)率及低出生體重率則與自然受孕者無明顯差異[5]。另外，研究顯示，單胚胎移植患者分娩的新生兒出生缺陷發(fā)生率分別為1.57%，而雙胚胎移植患者的則為1.64%，均低于國內(nèi)多中心研究報告的新生兒出生缺陷發(fā)生率（5.6%）[9]。

可見，雙胎妊娠屬于高危妊娠，與單胎相比有著更高的早產(chǎn)及低出生體重風(fēng)險，LAH對于胚胎發(fā)育的潛在影響也更容易顯現(xiàn)。然而，為了提高臨床妊娠率，改善妊娠結(jié)局，雙胚胎移植往往是很多醫(yī)生與患者的共同選擇。既往研究提示，對于雙胚胎移植的患者，LAH組著床率與雙胎率相對非LAH組有明顯提升[5]。本研究選擇LAH組和非LAH組胚胎移植的患者為研究對象，統(tǒng)計比較兩組胚胎存活情況;并選擇妊娠結(jié)局為雙胎活產(chǎn)的患者作為研究對象，統(tǒng)計比較兩組間雙胎新生兒及1歲齡嬰幼兒的發(fā)育狀況。結(jié)果顯示，LAH組與非LAH組患者活胎數(shù)為0個的比例分別為30.97% vs. 28.57%、活胎數(shù)為1個分別為51.97% vs. 51.73%、活胎數(shù)為2個的比例分別為17.06% vs. 19.70%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。妊娠結(jié)局為雙胎活產(chǎn)的患者，LAH組雙胎新生兒出生孕齡長于非LAH組，早產(chǎn)率分別為33.85%、36.26%。LAH組與非LAH組的A胎、B胎及總體新生兒的出生體重分別（2669.69±642.38）g vs. （2556.98±468.93）g、（2597.46±553.52）g vs. （2510.7±490.95）g及（2633.58±585.70）g vs. （2533.86±475.71）g，與國內(nèi)報道的活產(chǎn)雙胎出生體重（2.50±0.53）kg基本一致[18]。本研究結(jié)果顯示，LAH組出生的雙胎新生兒總體低體重兒率為19.23%，非LAH組為21.98%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），略低于先前研究中雙胎新生兒低體重率，分析可能與雙胎剖宮產(chǎn)孕齡選擇有關(guān)[19]。另外，本研究結(jié)果顯示，LAH組與非LAH組的雙胎新生兒畸形率分別為1.54%、0.55%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且均顯著低于2012年報道的我國出生缺陷率5.6%[15]，與報道的雙胚胎移植新生兒1.64%的出生缺陷率相仿[9]，Shats等[16]的研究認(rèn)為，LAH不增加新生兒的圍產(chǎn)期風(fēng)險，本研究之前的單胚胎移植后出生新生兒的結(jié)果也顯示，LAH組與對照組新生兒畸形率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示LAH組雙胎新生兒畸形率并未高于既往標(biāo)準(zhǔn)，但未來需增加研究病例數(shù)量獲得更為準(zhǔn)確可靠結(jié)果。

本研究曾對單胚胎移植后單胎活產(chǎn)的試管嬰兒1周歲發(fā)育情況進行隨訪，結(jié)果顯示，兩組雙胎嬰幼兒周歲體重均無異常，LAH組周歲身高無異常，非LAH組有2例身高發(fā)育遲緩（1.10%）。所有隨訪者的體重、運動能力、出牙情況、智力評估均未見異常。此前的一項單胚胎移植后單胎活產(chǎn)的前瞻性隊列研究也表明，ART后出生的嬰兒與自然受孕出生的嬰兒在2周歲時的認(rèn)知、運動和語言能力方面比較無明顯差異[20]。本研究的研究對象為雙胚胎移植后雙胎活產(chǎn)的試管嬰兒，結(jié)果提示即使是雙胎妊娠的試管嬰兒，LAH也不會引起嬰幼兒發(fā)育遲緩或發(fā)育異常。

綜上所述，對雙胚胎移植后雙胎分娩的試管嬰兒研究中，LAH的應(yīng)用對雙胚胎移植著床后胚胎存活情況及雙胎分娩的新生兒發(fā)育、1周歲嬰幼兒發(fā)育均無明顯影響，對于雙胎新生兒畸形率的影響尚需更多病例的研究。至于LAH對雙胎分娩子代發(fā)育的長期影響，課題組也將長期關(guān)注。另外，本研究對于患者的吸煙、居住環(huán)境、飲食等信息未予區(qū)分，因此上述因素是否對胚胎著床成功率、妊娠結(jié)局及嬰幼兒正常發(fā)育造成一定影響尚未可知，在后續(xù)研究中將考慮更多變量對結(jié)局指標(biāo)造成的影響。

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（收稿日期：2021-02-22）