自制漱口水治療創(chuàng)傷型口腔潰瘍作用及機制

吳子湘　張煒鵬　童熠瑜　湛晶蕾　梅梓楠　盧麗潔　孫鈺卓　張孔勝　王浩冰　譚健

[關鍵詞] 口腔潰瘍;大鼠;漱口水;云南白藥;炎癥因子

[中圖分類號] R248? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）23-0030-05

Effect and mechanism of self-made mouthwash on traumatic oral ulcer

WU Zixiang? ?ZHANG Weipeng? ?TONG Yiyu? ?ZHAN Jinglei? ?MEI Zi′nan? ?LU Lijie? ?SUN Yuzhuo? ?ZHANG Kongsheng? ?WANG Haobing? ?TAN Jian

School of Stomatology， Changsha Medical College， Changsha? ?410219， China

[Abstract] Objective To observe the effect and mechanism of homemade mouthwash on traumatic oral ulcer SD rat model. Methods Chemical burning method was used to establish oral ulcer model. Electronic vernier caliper was used to measure the maximum transverse diameter and maximum longitudinal diameter of the wound. The area was recorded and calculated. The weight of each group of rats before modeling and during treatment was recorded and compared. The levels of TNF-α and IL-6 in each group were detected using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The evaluation standard was graded according to the wound condition. The rats were sacrificed after the experiment. The pathological tissues were cut out. And the histopathological changes were observed by HE staining. Results Seven days after treatment， the oral ulcer area in the group D was? （0.93±0.27） mm2，which was significantly smaller than that of （1.39±0.22） mm2 in the group C and （4.60±1.19） mm2 in the group B， and the difference was statistically significant （P<0.05）. At seven days after treatment， the weight of rats in the group D was（215.50±2.94） g， which was the closest to group A （229.75±6.15） g， followed by the group C （207.81±2.20） g， and finally the group B （191.25±4.30） g. The body weights of rats in group B， C and D were significantly different from those in group A （P<0.05）. Seven days after treatment， the difference in the expression levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-6 in each group was statistically significant （P<0.05）. Among them， the TNF-α （285.38±3.48） ng/L and IL -6 level of the group D was （69.81±3.20）pg/mL，which was significantly lower than that of （346.69±26.40）ng/L， （93.31±3.40）pg/mL in group B and （305.13±5.48）ng/L，? （80.50±2.60） pg/mL in the group C， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Seven days after treatment， HE staining of the wound showed that the number of inflammatory cells in the group D was less than that in the group C， and significantly less than that in the group B. Fibroblasts in the group D proliferated significantly and new capillaries increased significantly. Conclusion Self-made mouthwash has a good effect on promoting healing and anti-inflammatory in SD rats with traumatic oral ulcer.

[Key words] Oral ulcer;Rats; Mouthwash; Yunnan Baiyao; Inflammatory factors

口腔潰瘍（Oral ulcer）可以歸屬為口腔黏膜較常見、多發(fā)類疾病之一[1]。目前由于創(chuàng)傷型口腔潰瘍病因尚未明確，大多學者認為口腔潰瘍發(fā)病原因可能與患者自身免疫功能出現(xiàn)紊亂、所處發(fā)育階段、婦女妊娠期、某些藥物的過多使用、感染、精神狀態(tài)、內分泌失調、身體其他系統(tǒng)疾病等有關，現(xiàn)階段學者比較一致的認為，免疫學因素在其致病機制中所占比例較大并起著重要作用[2-3]。本實驗所自制精油漱口水主要是以茶樹精油（Tea tree essential oil，TTO）、葡萄柚精油（Grapefruit essential oil，GEO）和木糖醇為主要成分，外加酒精、蒸餾水稀釋。漱口水pH值控制在合理區(qū)間，不會引起大鼠口腔酸化而導致脫鈣，不影響正常進食;本實驗利用兩種精油和木糖醇各自作用機制、抗炎、抗菌及促愈合等性質，探討自制漱口水對模型大鼠口腔潰瘍作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠64只，體重（200±210）g，雌雄各半，實驗SD大鼠購自長沙市天勤生物有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2019-0014。動物飼養(yǎng)和處理均按照長沙醫(yī)學院動物實驗房規(guī)定操作進行。本研究獲得學校倫理委員會批準通過。所購大鼠牙體、牙列完整、咬合關系正常。

1.2 實驗試劑及藥物

NaOH晶體（購自雙遼蒙東化工有限公司）;水合氯醛原料（質量分數(shù)99.7%，購自陜西正一藥用輔料有限公司）;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（購自武漢純度生物公司）;云南白藥粉（云南白藥集團股份公司，國藥準字Z53020798，規(guī)格：4 g/瓶）;茶樹精油（TTO，純度98%，江西康盛堂藥業(yè)有限公司）;葡萄柚精油（GEO，純度98%，廣東棟方生物科技股份有限公司）;木糖醇（山東龍力生物科技有限公司）;75%醫(yī)用酒精（皖衛(wèi)消證字[2020]第K0062號）;蒸餾水（由長沙醫(yī)學院基礎醫(yī)學院化學實驗室提供）。

1.3實驗方法

1.3.1 漱口水的制備? 在適應性飼養(yǎng)的同時制備漱口水：酒精20 mL、蒸餾水100 mL、TTO 1 mL、GEO 0.6 mL，木糖醇10 g。將酒精倒入玻璃瓶中，加入TTO和GEO，充分搖晃，再將蒸餾水和木糖醇倒入玻璃瓶中即可，漱口水有效成分含量為11.6 mL，濃度約為8.8%（課題組預實驗結果）。

1.3.2 動物模型的建立? 為使所形成的潰瘍創(chuàng)面大小一致，由同一人操作。采用4%水合氯醛麻醉后，用鑷子取NaOH晶體在大鼠左側頰部靠口角黏膜處燒灼60 s，隨后用生理鹽水沖洗，30 min后觀察上唇內側口腔黏膜灼燒面。形成直徑約5 mm、深度約2 mm的圓形或橢圓形創(chuàng)面[4]。

1.3.3 分組及實驗給藥? 將64只大鼠隨機分成四組，每組各16只，分別為空白對照組（A組）：不做處理，正常飼養(yǎng);模型對照組（B組）：采用4%水合氯醛麻醉后，僅用生理鹽水每天涂敷兩次，早晚各1次，連續(xù)給藥7 d;云南白藥組（C組）：采用4%水合氯醛麻醉后，先使用生理鹽水沖洗創(chuàng)面，再用消毒棉簽蘸取云南白藥粉均勻涂敷在口腔潰瘍處，分別于每日清晨、夜晚各給藥1次，給藥后30 min不予進食，連續(xù)給藥7 d;茶樹精油組（D組）：采用4%水合氯醛麻醉后，先使用生理鹽水沖洗創(chuàng)面，再用消毒棉簽蘸取自制漱口水涂敷在口腔潰瘍處3 min，分別于每日清晨、夜晚各給藥一次，給藥后30 min不予進食，連續(xù)給藥7 d 。

1.4觀察指標及評價標準

①分別在治療后1 d、3 d、5 d、7 d給藥前的早晨用電子游標卡尺測量大鼠創(chuàng)面最大橫徑與最大縱徑，觀察愈合情況，并計算面積。記錄造模前大鼠體重和造模后每天給藥前大鼠的體重，并比較在治療過程中各組大鼠每天的體重。②治療后7 d，各組大鼠尾靜脈取血3 mL，裝入5 mL采血管內，室溫靜置60 min，隨后采用3000 r/min離心機，離心20 min后收集上層血清，采用ELISA法測定血清炎癥指標TNF-α、IL-6水平（具體操作按試劑說明書）。③治療后7 d，對各組大鼠口腔黏膜情況進行評價標準分級[4]，0級：創(chuàng)面完全愈合;Ⅰ級：創(chuàng)面未完全愈合，但無明顯假膜;Ⅱ級：創(chuàng)面表面可見黃白色薄的假膜覆蓋;Ⅲ級：創(chuàng)面表面假膜較厚，周圍可見充血、水腫;Ⅳ級：創(chuàng)面表面假膜厚，周圍充血、水腫嚴重。正常為0分，Ⅰ級為1～3分，Ⅱ級為4～6分，Ⅲ級為7～9分，Ⅳ級為10～12分。④各組大鼠尾靜脈取血完成后，對大鼠實行安樂死，隨后打開大鼠口腔，切取左側頰黏膜病理組織約2 mm深度，隨即置于4%的福爾馬林組織固定溶液中固定1周，再按常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosinstaining，HE），置于光學顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用獨立性t檢驗，分級采用非參數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組SD大鼠口腔潰瘍面積變化情況比較

治療后1 d，各組大鼠潰瘍面積比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），治療后3 d、5 d及7 d各組大鼠潰瘍面積逐步縮小，C組與B組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;D組與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組SD大鼠不同時間體重變化情況比較

造模后各組大鼠體重均有明顯下降趨勢（除A組外），B、C、D組大鼠體重變化與造模前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），B組第6天大鼠體重開始增加，C組第4天開始增加，D組第3天開始增加，B、C、D組體重開始增加時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），治療第7天后B、C、D組與A組體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與A組接近大小順序為D組>C組>B組，提示自制漱口水可以縮短愈合和疼痛時間，提前恢復正常生活。見表2。

2.3 各組SD大鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6檢測水平比較

與A組比較，B組大鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），同時C組和D組TNF-α和IL-6水平明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），D組TNF-α和IL-6水平低于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。自制漱口水治療大鼠口腔潰瘍模型機制或許與炎癥細胞因子導致的免疫功能調節(jié)有關。見表3。

2.4 各組大鼠病理組織變化情況

HE染色后，光鏡下（×40）觀察各組病理切片（封三圖1），可見A組組織之間結構緊密，未見炎癥細胞;B組觀察到淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞積聚浸潤明顯，血管充血、水腫嚴重、纖維結締組織疏松和少見新生毛細血管;C組可觀察到少量炎癥細胞浸潤，可見明顯的新生毛細血管和近似成纖維細胞，組織血管充血、水腫情況得到改善，但仍然存在;D組可見較大量明顯的新生毛細血管和成纖維細胞，炎癥細胞較少見，存在輕微血管充血、水腫情況，但情況明顯好于B組，較好于C組。

2.5 模型建立初和治療后7 d各組大鼠口腔黏膜變化情況比較

模型建立初和治療后7 d，觀察各組大鼠口腔黏膜變化情況（封三圖2）。大鼠口腔潰瘍建模30 min后，可觀察到頰側創(chuàng)口黏膜組織充血、水腫嚴重;B組給予生理鹽水治療后7 d，觀察大鼠自我愈合能力，還能觀察到創(chuàng)口面積大，黏膜組織充血、水腫較嚴重，可見明顯較厚假膜;C組給予云南白藥治療后7 d，口腔潰瘍面積縮小顯著，黏膜組織充血、水腫情況得到很大改善，但還可觀察到組織有充血、水腫情況;D組給予自制漱口水治療后7 d，口腔潰瘍面積顯著縮小，黏膜組織充血、水腫很大程度上改善，無出血、水腫或輕微出血、水腫情況，潰瘍雖未完全達到建模前水平但無明顯假膜，接近愈合，且恢復情況均顯著好于B組和C組。

3 討論

口腔潰瘍是發(fā)生于患者口腔黏膜上的一類臨床多見疾病[5]，患病率相對較高。該病的發(fā)生具有反復性及潰瘍創(chuàng)面具有自我轉愈等多種臨床表征，當下雖然有許多治療方法，但缺乏有效的方法，且對口腔潰瘍的診斷大多基于病案及臨床癥狀[6-7]。在口腔潰瘍病因機制未知的情況下，目前常用于治療口腔潰瘍的藥物包括消炎止痛類藥物、促進愈合類藥物、糖皮質激素類藥物、免疫調節(jié)類藥物等，但都不能從根源上治愈[8]。

通過相關治療口腔潰瘍藥物的機制研究發(fā)現(xiàn)，該病的發(fā)生與免疫功能調節(jié)有關，機體中的淋巴細胞和單核細胞釋放的某些炎癥因子均可誘導口腔潰瘍的形成，其中TNF-α和IL-6為其重要炎癥因子，起到關鍵作用[9-12]。炎癥因子TNF-α和IL-6參與機體免疫功能的調節(jié)，如果機體有炎癥形成而引起潰瘍時TNF-α和IL-6水平將大幅上升，自制漱口水治療大鼠口腔潰瘍模型的作用及機制可能與炎癥因子引起的免疫功能調節(jié)有關，通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-6分泌，進而促使疾病轉愈[13-15]。

TTO是從桃金娘科互葉白千層的新鮮枝葉中提取出來的一種天然的香料油，該精油除了能發(fā)揮很好的殺菌抑菌功能，添加在日常護膚品中還能起到保健作用，且本身無毒害。據(jù)學者研究，TTO中含有一種松油烯-4-醇的成分，松油烯-4-醇在抗炎作用中起到關鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TTO不僅具有抗炎作用，還具有促進愈合、抗腫瘤作用，而且其安全性可靠[16]。之前有研究顯示，TTO對某些有害機體的細菌有較強抑制性和殺傷性，TTO可以殺死耐甲氧西林金葡菌和金黃色葡萄球菌，其與熏衣草精油混合還是自制傷口軟膏中的完美成分，可以促進傷口愈合;漱口水另一種成分GEO，其是一種安全、天然的抑菌劑和抗氧化劑，其作為一種重要的食品添加劑用于食品中，且可以調節(jié)血壓、增強食欲等[17]。近些年，有研究顯示，GEO對較多微生物的殺滅性、抑菌能力、修復作用及在受藥耐藥方面、殘留方面均比大多化學類人工合成藥品有明顯的優(yōu)勢，具有廣泛的開發(fā)利用及推廣前景[18];第三種成分是木糖醇，常用于無糖口香糖中，其具有防齲、消炎抗菌等功能，并擁有良好的甜味，加在漱口水中可以起到加香作用，還會增強漱口水清涼感[19]。云南白藥可抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達，對控制炎癥的發(fā)展起到一定的作用，且具有活血化瘀、消腫止痛之功效，其有明顯的止血作用，可加速血管的生長及結締組織增生，加速創(chuàng)面肉芽組織增生和上皮細胞增殖，防止繼發(fā)感染，促進傷口愈合，減輕疼痛，縮短療程，且在臨床上治療口腔潰瘍、皮膚創(chuàng)傷、出血等有良好功效[20]。因此，本研究選擇自制漱口水為實驗組用藥，云南白藥為陽性對照組用藥，生理鹽水為陰性對照組用藥。

本研究結果顯示，自制漱口水與云南白藥作用比較，自制漱口水療效顯著，且可加速促進大鼠口腔黏膜修復，明顯縮短潰瘍愈合時間，顯著抑制炎癥因子TNF-α和IL-6生成和釋放，可能與漱口水中含有多種抗炎、促愈合類藥物成分之間的協(xié)同作用有關。本研究首次將TTO、GEO及木糖醇應用于治療口腔潰瘍的動物實驗中，也是首次將木糖醇配合兩種精油制作成漱口水。依據(jù)以往研究結果顯示，TTO和GEO作為天然藥物具有取材廣、安全、毒副作用小等優(yōu)點，用于口腔疾病的預防與治療中有著巨大的優(yōu)勢和潛力，且前景廣泛，加上木糖醇具有可食用性，故預實驗及正式實驗中大鼠未出現(xiàn)明顯不良反應或毒性作用，但還需要大量的動物和臨床實驗證實，臨床實驗中應更加關注患者的個體差異性和藥物的安全性及有效性。因此，本實驗為今后口腔潰瘍的臨床治療及該自制漱口水的推廣應用提供一定實驗室依據(jù)和可支撐數(shù)據(jù)，希望在臨床應用中對自制漱口水預防和治療口腔潰瘍的最佳作用時間、用法及安全等情況開展進一步的研究。

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（收稿日期：2021-02-02）