基于XGBoost方法的大腸桿菌-NC膜復(fù)合電極阻抗模型研究

徐 瑩 陳揚(yáng)孜 劉 哲 孫樂(lè)圣 姜 揚(yáng) 郭 淼

1(杭州電子科技大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，杭州 310018)

2(杭州電子科技大學(xué)信息工程學(xué)院，杭州 311305)

引言

XGBoost是基于GBDT而逐漸發(fā)展成熟起來(lái)的算法，由于其優(yōu)良的運(yùn)算速度和機(jī)制被研究者當(dāng)作各種數(shù)據(jù)初始模型備選并廣泛使用[1-2]。其針對(duì)非線(xiàn)性小樣本數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的泛化能力和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，當(dāng)前在生物電化學(xué)領(lǐng)域逐步發(fā)展起來(lái)，可用于定量分析一些生物電化學(xué)量。因此，XGBoost方法應(yīng)用于電化學(xué)阻抗數(shù)據(jù)，是非常有力的一種研究工具[3]。

食源性傳播是大腸桿菌O157: H7實(shí)現(xiàn)傳染的首要傳播途徑，因此在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中快速實(shí)時(shí)的對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)的需求迫在眉睫[4]。電化學(xué)生物阻抗譜法因其響應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)單、精度高等優(yōu)點(diǎn)常用于細(xì)菌檢測(cè)。如王澤華等[5]通過(guò)電沉積納米金修飾16通道絲網(wǎng)印刷電極，采用雙抗夾心法構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于前列腺癌患者PSA檢測(cè)，在臨床醫(yī)學(xué)診斷前列腺癌患者具有重大意義。陳靜等[6]使用金納米顆粒等修飾電極在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)谷氨酸微生物，通過(guò)阻抗譜和循環(huán)伏安法評(píng)估了神經(jīng)傳遞和腦功能中谷氨酸水平，在神經(jīng)科學(xué)研究中是很有前途的工具。電化學(xué)阻抗譜生物傳感器對(duì)一些檢測(cè)難度較大的生物組分，在不同頻率下施以小振幅正弦信號(hào)并測(cè)量其電響應(yīng)，從電化學(xué)特征推測(cè)等效電路，并通過(guò)Zview軟件對(duì)實(shí)際阻抗圖進(jìn)行擬合，即可得到相應(yīng)的阻抗參數(shù)[7-8]。電化學(xué)阻抗譜的各參數(shù)代表不同物理量，可定量或者定性研究其代表的物理量，是電化學(xué)測(cè)試主要研究?jī)?nèi)容[9-10]。其中經(jīng)典檢測(cè)方法分為循環(huán)伏安法、交流阻抗法、脈沖伏安法和計(jì)時(shí)電流法，不同檢測(cè)方法可得到不同特征參數(shù)[11]。在菌類(lèi)檢測(cè)領(lǐng)域，根據(jù)免疫反應(yīng)，待測(cè)細(xì)菌與特異性物質(zhì)(抗體)結(jié)合在電極表面形成膜結(jié)構(gòu)，交流阻抗法可研究生物膜的阻抗、電容及其他參量，以研究微生物在電極表面的活性狀態(tài)，從而表征生物信息學(xué)行為[12-13]。

自新冠疫情爆發(fā)以來(lái)，民眾愈加重視日常衛(wèi)生問(wèn)題，但過(guò)度重視可能導(dǎo)致抗生素、抑制劑、蛋白酶抑制劑等常規(guī)有效滅菌消毒藥物的過(guò)度使用和不合理應(yīng)用日趨嚴(yán)重，最直接的危害是造成細(xì)菌耐藥，甚至對(duì)生存的環(huán)境造成污染[14]。濫用抗生素造成的細(xì)菌耐藥性已成為全球衛(wèi)生、食品安全和發(fā)展的最大威脅之一。因此，研發(fā)出一種快速高效準(zhǔn)確檢測(cè)微生物濃度含量、間接反映不同梯度臨界閾值抗生素抑制效果的方法至關(guān)重要，但目前電化學(xué)數(shù)據(jù)的分析仍基本處于線(xiàn)性擬合分析或阻抗數(shù)據(jù)單參數(shù)分析法階段，耗時(shí)耗力，且由于擬合手段有限，導(dǎo)致得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)適用區(qū)間極度受限[15]。在現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析方法基礎(chǔ)上，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立數(shù)據(jù)量化分析模型對(duì)EIS進(jìn)行分析。常用的方法是支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)和隨機(jī)森林(random forest, RF)，這兩種方法預(yù)測(cè)結(jié)果精確，而且參數(shù)較少，使用方便，但對(duì)于電化學(xué)阻抗等多樣化數(shù)據(jù)，SVM和RF方法處理速度較慢，分類(lèi)結(jié)果準(zhǔn)確度較差[16]。2012年，在Kaggle競(jìng)賽中，Cruse等[17]提出了一種名為極端梯度增強(qiáng)的算法(XGBoost)，通過(guò)加入新的弱學(xué)習(xí)器，糾正前面所有弱學(xué)習(xí)器的殘差，最終多個(gè)學(xué)習(xí)器相加在一起用以進(jìn)行預(yù)測(cè)以提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。XGBoost因其優(yōu)良的運(yùn)算速度以及良好的延展性解決多參數(shù)、高度非線(xiàn)性問(wèn)題具有巨大優(yōu)勢(shì)。Ahamad等[18]使用多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法識(shí)別特征，預(yù)測(cè)COVID-19疾病，其中XGBoost算法以最高準(zhǔn)確度(>85%)預(yù)測(cè)和體現(xiàn)COVID-19最顯著的臨床癥狀。大數(shù)據(jù)高速發(fā)展時(shí)代下，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域數(shù)據(jù)也隨之變得復(fù)雜多樣，機(jī)器學(xué)習(xí)與現(xiàn)代醫(yī)療相輔相成，XGBoost以其高準(zhǔn)確性、快速計(jì)算速度等優(yōu)勢(shì)在疾病診斷預(yù)測(cè)、抗菌藥物選擇指南等人工智能醫(yī)療輔助診斷頗受青睞，醫(yī)務(wù)人員的工作量得到減輕，診斷治療方面的生產(chǎn)力極大提高[19-21]。

本研究在電化學(xué)生物傳感檢測(cè)原有基本原理基礎(chǔ)上，在生物分子固定、數(shù)據(jù)量化處理等方面進(jìn)行了改進(jìn)，針對(duì)原有自組裝修飾電極的修飾步驟繁瑣等缺點(diǎn)，采用電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，利用硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC膜)作為過(guò)渡支架，結(jié)合納米金顆粒并吸附大腸桿菌抗體，再通過(guò)特異性位點(diǎn)結(jié)合捕獲大腸桿菌進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)獲取不同濃度下的大批量電化學(xué)阻抗數(shù)據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及增加實(shí)驗(yàn)樣本量；然后采用XGBoost訓(xùn)練擬合后的數(shù)據(jù)，建立菌類(lèi)濃度預(yù)測(cè)體系，用于預(yù)測(cè)被測(cè)樣本中菌液濃度；并用該分析模型初步分析不同濃度硫酸阿米卡星抗生素作用于大腸桿菌后對(duì)應(yīng)的菌液生長(zhǎng)情況，從而對(duì)抗生素微量梯度濃度作用效果評(píng)價(jià)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1 材料和方法

系統(tǒng)流程如圖1所示，基于XGBoost機(jī)器學(xué)習(xí)方法的大腸桿菌-NC膜復(fù)合阻抗模型主要包括菌液培養(yǎng)、電極構(gòu)建、電化學(xué)阻抗測(cè)試、特征提取和XGBoost模型訓(xùn)練預(yù)測(cè)等5個(gè)步驟。

圖1 系統(tǒng)流程Fig.1 System flow diagram

1.1 試劑與儀器

CHI760E電化學(xué)工作站，采購(gòu)于上海辰華儀器有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗儀，采購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司；SX-500高溫高壓滅菌鍋，采購(gòu)于TOMY；ZHJH-C1106C超凈臺(tái)，采購(gòu)于鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MCO-15AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，采購(gòu)于Sanyo；BSA124S-CW精密天平，采購(gòu)于Sartorius；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2600，采購(gòu)于島津公司；金電極、Ag/AgCl電極、鉑絲電極，均采購(gòu)于天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；微量移液器，采購(gòu)于Eppendorf；0.45 μm孔徑NC膜采購(gòu)于Biosharp；硫酸阿米卡星注射液采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌菌株、抗體均購(gòu)買(mǎi)于生工生物工程(上海)股份有限公司。菌類(lèi)相關(guān)試劑皆經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌。

1.2 固定液的配置

在超凈臺(tái)內(nèi)于冰上使用移液槍將3 mL納米金膠體(0.1 g/L，<10 nm)加入3 mL 2.5×10-2mg/mL大腸桿菌多克隆抗體中，吹打混勻，在8℃下攪拌10 min(慢速)并靜置15 min后放于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大腸桿菌培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌均為生工生物工程(上海)股份有限公司的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。大腸桿菌于滅菌后的LB瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，使用槍頭蘸取單個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落移至滅菌后的LB肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩器37℃，180 r/min下培養(yǎng)至細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，繼續(xù)培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液樣本，經(jīng)0.1 M PBS(pH值為7.4)緩沖液多次重懸至上清液清澈，4℃冰箱儲(chǔ)存以用于后續(xù)電化學(xué)檢測(cè)。使用分光光度計(jì)在600 nm下檢測(cè)菌液樣本OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)大致計(jì)算出菌液濃度，作為后續(xù)電化學(xué)生物膜檢測(cè)的參考值。當(dāng)大腸桿菌菌液分光光度為0.1(約1.3×108CFU/mL)時(shí)，為標(biāo)準(zhǔn)菌液。

1.4 抗生素抑制實(shí)驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌液(OD600值為0.1)等量分裝至4個(gè)滅菌后的燒瓶中，使用移液槍依次加入5、10、15 μL的0.1 g/mL硫酸阿米卡星注射液，分別標(biāo)記為A、B、C組，以未加抗生素的D組為空白對(duì)照組，放于恒溫振蕩器37℃，180 r/min下培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣記錄菌液的OD600值以觀(guān)察加藥后大腸桿菌生長(zhǎng)變化。培養(yǎng)至3 h時(shí)，取4組實(shí)驗(yàn)組樣本經(jīng)0.1 M PBS(pH值為7.4)緩沖液多次重懸至上清液清澈，4℃冰箱儲(chǔ)存以用于后續(xù)用于電化學(xué)阻抗測(cè)試。

1.5 電化學(xué)阻抗系統(tǒng)

圖2為電化學(xué)阻抗系統(tǒng)測(cè)試平臺(tái)。電化學(xué)測(cè)試采用三電極系統(tǒng)，使用自制分離槽(見(jiàn)圖2(a))固定NC膜，并將工作電極(金電極)與對(duì)電極(鉑絲電極)、參比電極(Ag-AgCl電極)分隔開(kāi)，3個(gè)電極分別通過(guò)導(dǎo)線(xiàn)與CHI760E電化學(xué)工作站連接(見(jiàn)圖2(b))。

圖2 電化學(xué)阻抗測(cè)試平臺(tái)。(a)自制分離槽；(b)阻抗測(cè)試平臺(tái)Fig.2 Diagram of electrochemical impedance test platform. (a) Self-made separation tank; (b) Impedance test platform

1.6 大腸桿菌-NC膜-金電極構(gòu)建及阻抗測(cè)量

進(jìn)行測(cè)試前需要對(duì)每個(gè)電極進(jìn)行打磨清洗以保證電極表面的干凈和平整，使用循環(huán)伏安法對(duì)電極進(jìn)行檢驗(yàn)，初始電壓和終電壓分別設(shè)置為-0.6和0.4 V，掃描速率為100 mV/s。氧化峰和還原峰峰值電位差小于0.07 V時(shí)，表明電極界面狀態(tài)較好，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

將NC膜裁剪成1 cm×1 cm的大小，放于固定液中浸泡20 min，取出干燥后放于0.1 M PBS(pH值為7.4)大腸桿菌菌懸液中孵化12 h(4℃)后，取出NC膜置于分離槽卡口上，旋緊使膜保持固定，金電極垂直放置于膜表面，其余兩電極放于另一格內(nèi)，倒入阻抗測(cè)試液，浸沒(méi)3根電極，測(cè)量交流阻抗數(shù)據(jù)，每組測(cè)量10次，取平均值作為EIS數(shù)據(jù)。

1.7 等效模型

電化學(xué)阻抗譜用于研究電極界面的特性，該界面通常由等效電路建模，由等效模型主要電參數(shù)代表一條阻抗數(shù)據(jù)，常用Randles模型體現(xiàn)細(xì)菌引起的電化學(xué)阻抗譜變化，該模型最早是Giaever和Keese在1984年提出并應(yīng)用于細(xì)胞電阻抗傳感器，主要測(cè)量4 kHz頻率下阻抗隨時(shí)間變化建立模型[22]。Randles模型主要輸出電荷轉(zhuǎn)移電阻，雙電層電容和電解質(zhì)的溶液電阻。電荷轉(zhuǎn)移電阻控制電極界面上氧化還原探針的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)，即由于離子從本體電解質(zhì)擴(kuò)散到電極而產(chǎn)生的Warburg阻抗(用W表示)。使用Zview軟件的Randles模型對(duì)測(cè)試得到的阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，將體現(xiàn)電極界面變化信息的復(fù)雜電化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成可以量化的電學(xué)變量，擬合后獲取的電學(xué)參數(shù)用于后續(xù)機(jī)器學(xué)習(xí)的訓(xùn)練。

電極修飾結(jié)構(gòu)模型如圖3(a)所示，當(dāng)細(xì)菌等生物膜固定在電極表面后，引起電極生物膜阻抗參數(shù)相應(yīng)變化。未加修飾層的裸金電極(bare gold electrode, GE)其等效模型電路如圖3(b)所示，將電極、電解液及電極間的電荷傳輸難易程度視為等效阻抗Rs，同時(shí)控制電荷轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的法拉第阻抗由電極極化電阻Rb和常相位元件(constant phase element, CPE)并聯(lián)構(gòu)成。當(dāng)吸附抗體和大腸桿菌的NC膜貼附于金電極表面后，工作電極與其他兩電極間存在一層生物膜，一定程度上阻礙了氧化還原物質(zhì)在電極表面的離子交換，此時(shí)的等效模型如圖3(c)所示，主要增加了大腸桿菌阻抗(C2，R2)，以及菌與NC膜之間阻抗R1和電容C1。通過(guò)簡(jiǎn)化模型可將細(xì)菌、NC膜復(fù)合為一個(gè)以NC膜為主的RC阻抗單元，且與雙電層電容呈并聯(lián)回路。簡(jiǎn)化后基于E.coli-Anti-AuNPs-NC-GE的系統(tǒng)等效電路最終如圖3(d)所示，該模型與經(jīng)典模型Randles大致相同[23-24]，但各個(gè)等效模型參量大小發(fā)生變化，且電化學(xué)決策分量不同。

圖3 等效電路圖及電極結(jié)構(gòu)。(a)修飾后電極界面結(jié)構(gòu)；(b)裸金電極GE等效電路模型；(c)E. coli-Anti-AuNPs-NC-GE等效電路模型；(d)簡(jiǎn)化后等效電路模型Fig.3 Equivalent circuit diagram and electrode structure diagram. (a) Interface structure diagram of the modified electrode; (b) Ge equivalent circuit model of bare gold electrode; (c) E. coli-Anti-AuNPs-NC-GE equivalent circuit model; (d) Simplified equivalent circuit model

1.8 主成分分析法

機(jī)器學(xué)習(xí)在處理小樣本數(shù)據(jù)集的速度和精確度上有很大的優(yōu)勢(shì)，且適用于多特征分析，對(duì)非線(xiàn)性數(shù)據(jù)集具有較好的適用性，因此適用于的多參數(shù)量化細(xì)菌濃度模型。由Randles模型得到4個(gè)電學(xué)元件及對(duì)應(yīng)的7個(gè)電學(xué)參數(shù)(Rs，CPE-T，CPE-P，W-T，W-P，W-R，R1)，以往的細(xì)菌電化學(xué)檢測(cè)常關(guān)注電荷轉(zhuǎn)移電阻與細(xì)菌濃度之間的關(guān)系進(jìn)行分析，但當(dāng)形成的生物膜貼附于電極表面時(shí)，其他阻抗參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響也不可忽略。為節(jié)省處理時(shí)間，同時(shí)避免忽略重要參數(shù)，進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)前，先采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。

1.9 XGBoost機(jī)器學(xué)習(xí)方法

XGBoost在Gradient Boosting框架下實(shí)現(xiàn)機(jī)器學(xué)習(xí)算法，是一個(gè)優(yōu)化的分布式梯度增強(qiáng)庫(kù)。利用網(wǎng)格搜索函數(shù)GridSearchCV按照順序分別對(duì)迭代次數(shù)、樹(shù)的權(quán)重、樹(shù)的深度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化確定最佳數(shù)值。通過(guò)極限梯度增強(qiáng)(XGBoost)建立基于機(jī)器學(xué)習(xí)的量化分析模型來(lái)測(cè)定菌液濃度和抗生素濃度。

1.9.1大腸桿菌菌液濃度預(yù)測(cè)模型

將同一濃度下不同培養(yǎng)時(shí)間間隔樣本的3組阻抗數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)源放入XGBoost中進(jìn)行訓(xùn)練確定其模型結(jié)構(gòu)(節(jié)點(diǎn)數(shù)、深度)。將主成分分析后的主要參數(shù)數(shù)據(jù)集作為模型輸入，以菌液濃度作為模型輸出，通過(guò)多次迭代，建立可預(yù)測(cè)大腸桿菌濃度的XGBoost回歸模型?？偣膊杉?個(gè)不同濃度(3.3×108、4.0×108、4.8×108、5.8×108、9.4×108CFU/mL)下的500組阻抗數(shù)據(jù)(電極直徑2 mm)。隨機(jī)選取20%數(shù)據(jù)作為測(cè)試集，其余數(shù)據(jù)集作為訓(xùn)練集導(dǎo)入并對(duì)初始化的XGBoost模型進(jìn)行訓(xùn)練，且為了使量化模型可以更好地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，在訓(xùn)練集中隨機(jī)抽取50%數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證集用于參數(shù)調(diào)整。

1.9.2抗生素濃度預(yù)測(cè)模型

為預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度大腸桿菌菌液中加入的低閾值抗生素含量，基于1.9.1節(jié)建立的XGBoost模型，采集400組數(shù)據(jù)，統(tǒng)一在菌液生長(zhǎng)至OD600值為0.1(約1.3×108CFU/mL)時(shí)分別加入3種不同濃度(0.1、0.2、0.3 μL/mL)硫酸阿米卡星后培養(yǎng)至3 h時(shí)，和未加藥的對(duì)照組大腸桿菌的EIS數(shù)據(jù)(電極直徑為2 mm)作為模型輸入，以加入的抗生素濃度作為模型輸出，建立可以預(yù)測(cè)抗生素濃度的XGBoost回歸模型。

1.9.3模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

以XGBoost模型中的均方根誤差、損失函數(shù)等作為執(zhí)行效率評(píng)價(jià)指標(biāo)，并對(duì)未知濃度的大腸桿菌EIS參數(shù)進(jìn)行回歸，輸出預(yù)測(cè)濃度。利用測(cè)試的電化學(xué)阻抗數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的實(shí)際濃度值對(duì)得到的模型預(yù)測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算均方根誤差等結(jié)果，對(duì)模型初步評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌表征結(jié)果

采用的修飾方法是基于大腸桿菌與NC膜結(jié)構(gòu)的特異性免疫結(jié)合，首先將含有納米金-抗體的固定液吸附于NC膜表面，再經(jīng)特異性反應(yīng)將大腸桿菌附著于NC膜。課題組多采用的基于納米金自組裝材料為核心的復(fù)合修飾方法中，為了表征以納米金顆粒等復(fù)合物修飾材料在電極表面的結(jié)合，對(duì)固定大腸桿菌的電極表面納米金復(fù)合物進(jìn)行紫外光譜測(cè)試，以表示結(jié)合納米金后復(fù)合材料的特征峰(見(jiàn)圖4(a))，以及與納米金顆粒結(jié)合后，固定大腸桿菌的掃描電鏡SEM表征(見(jiàn)圖4(b))，可看到納米金復(fù)合修飾物-大腸桿菌待測(cè)樣本中，大腸桿菌形態(tài)良好，較好地附著于材料表面。因此，采用的NC膜-納米顆粒-抗體-大腸桿菌方法可應(yīng)用于固定大腸桿菌，并進(jìn)行下一步定量的各修飾層-阻抗變化的電化學(xué)阻抗測(cè)試實(shí)驗(yàn)。

圖4 表征結(jié)果。(a)紫外表征圖；(b)掃描電鏡圖(SEM)Fig.4 Characterization results. (a) UV characterization; (b) Scanning electron microscopy (SEM)

2.2 大腸桿菌的電化學(xué)阻抗檢測(cè)結(jié)果

奈奎斯特(Nyquist)電化學(xué)阻抗譜圖(阻抗虛部與實(shí)部)包括一個(gè)直徑為電子轉(zhuǎn)移電阻的半圓形部分和一個(gè)具有控制擴(kuò)散電流低頻特性的線(xiàn)性部分。隨著電極界面信息變化，Nyquist圖也發(fā)生相應(yīng)變化，通過(guò)分析阻抗譜間接得到細(xì)菌濃度的變化。

實(shí)驗(yàn)選擇幾種常用規(guī)格電極后，綜合考慮電化學(xué)測(cè)試中的體阻抗大小、測(cè)試重復(fù)性、待測(cè)菌液濃度梯度變化等多重因素，最終采用2 mm直徑規(guī)格金電極作為工作電極進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)試。

2.2.1相同工作電極直徑(2 mm)下不同修飾層的阻抗譜

圖3(a)中描述了電極修飾過(guò)程，為更進(jìn)一步說(shuō)明修飾結(jié)構(gòu)的變化，在進(jìn)行大腸桿菌菌液濃度檢測(cè)前，需要通過(guò)對(duì)制備電極過(guò)程中的每層修飾層在0.1 M K3[Fe(CN)6]/FeCl3溶液中逐層測(cè)試交流阻抗變化，來(lái)表征修飾過(guò)程中電極表面的電化學(xué)性質(zhì)。

修飾層阻抗譜如圖5(a)所示，圖中4條曲線(xiàn)從下往上依次是裸金電極(GE)，NC膜-電極(NC-GE)，抗體-納米金-NC膜-電極(Anti-AuNPs-NC-GE)以及大腸桿菌-抗體-納米金-NC膜-電極(E.coli-Anti-AuNPs-NC-GE)。由圖5(a)可明顯看出隨著修飾層疊加，修飾層阻抗譜逐層增大。這是因?yàn)榇竽c桿菌抗體的結(jié)合阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移并使阻抗增大。大腸桿菌與抗體結(jié)合后，電極表面生物膜進(jìn)一步增厚，阻礙作用增強(qiáng)，阻抗也更大，與本文第1.7節(jié)每層修飾層等效模型理論分析結(jié)果相同，進(jìn)一步評(píng)估了采用的E.coli-Anti-AuNPs-NC膜復(fù)合結(jié)構(gòu)性能。同時(shí)，與傳統(tǒng)自組裝修飾電極的結(jié)果相比，基于NC膜的體阻抗雖然較大，但針對(duì)前者，其優(yōu)點(diǎn)是更換容易，操作便捷，重復(fù)性好，適于大批量檢測(cè)及多數(shù)據(jù)源分析。根據(jù)后期歸一化數(shù)據(jù)處理，可基本減少NC膜附著于電極所造成的阻抗增大影響。

圖5 阻抗譜圖。(a)不同修飾層的交流阻抗譜圖；(b)不同大腸桿菌濃度的交流阻抗譜圖；(c)加入不同濃度硫酸阿米卡星后隨培養(yǎng)時(shí)間變化的OD值(600 nm)；(d)加藥3 h時(shí)對(duì)應(yīng)的交流阻抗譜圖Fig.5 Impedance spectra. (a) AC impedance spectra of different modified layers; (b) AC impedance spectra of different concentrations of E. coli; (c) The OD value (600 nm) after adding different concentrations of amikacin sulfate with the change of culture time; (d) AC impedance spectra at 3 h after dosing

2.2.2相同工作電極直徑(2 mm)下不同濃度的大腸桿菌-NC膜-電極阻抗譜分析

圖5(b)中的5條曲線(xiàn)分別為大腸桿菌菌液濃度3.3×108～9.4×108CFU/mL下檢測(cè)的阻抗譜數(shù)據(jù)，由圖可知，隨著大腸桿菌菌液濃度的增大，生物膜阻礙作用增強(qiáng)，工作測(cè)試電極有效面積變小，系統(tǒng)阻抗越來(lái)越大，阻抗半徑越來(lái)越大(見(jiàn)圖5(b))，由此從定性結(jié)果說(shuō)明阻抗變化與被測(cè)菌液濃度具有一定規(guī)律，后續(xù)可通過(guò)阻抗譜變化，分析不同濃度抗生素對(duì)大腸桿菌抑制作用。

2.2.3相同工作電極直徑(2 mm)下不同抗生素濃度的菌液阻抗譜

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以檢測(cè)樣本OD600值作為簡(jiǎn)單定性標(biāo)準(zhǔn)，直觀(guān)觀(guān)測(cè)加入臨界閾值范圍抗生素后大腸桿菌菌液濃度長(zhǎng)時(shí)程變化趨勢(shì)。圖5(c)為標(biāo)準(zhǔn)菌液(OD600為0.1，約1.3×108CFU/mL)中加入不同濃度(0.1～0.3 μL/mL)的硫酸阿米卡星(0.1 g/mL)，隨培養(yǎng)時(shí)間增加OD600值的變化曲線(xiàn)，以不加抗生素菌液為對(duì)照組。當(dāng)加入抗生素后1 h時(shí)，此時(shí)菌液濃度較小，不同濃度抗生素對(duì)菌液有明顯短時(shí)抑制效果。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌液濃度逐漸增大，OD600值增速加快。到3 h時(shí)，加入抗生素的菌液OD600值雖然也在增加，但增速緩慢，藥物濃度較大(0.3 μL/mL)樣本細(xì)菌增長(zhǎng)速率出現(xiàn)明顯遞減趨勢(shì)，此時(shí)可看出4組樣本同時(shí)刻下的濃度梯度明顯差別，說(shuō)明硫酸阿米卡星對(duì)大腸桿菌的長(zhǎng)時(shí)程定性抑制效果明顯，可進(jìn)一步用機(jī)器學(xué)習(xí)方法精確分析抗生素濃度篩選模型。

圖5(d)利用交流阻抗對(duì)加藥3 h時(shí)3種抗生素濃度作用下大腸桿菌生長(zhǎng)情況檢測(cè)，總趨勢(shì)為同時(shí)刻下，隨著抗生素濃度增加，對(duì)細(xì)菌抑制作用也越強(qiáng)，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)抗體特異性結(jié)合的大腸桿菌數(shù)量隨抗生素濃度增加而減小，從而影響電極表面電化學(xué)極化過(guò)程。隨著抗生素濃度增加，大腸桿菌生長(zhǎng)速度受限，同時(shí)間樣本中抗生素濃度越高的組中抗體與大腸桿菌結(jié)合率越低?？股刈饔铆h(huán)境下大腸桿菌樣本的交流阻抗結(jié)果隨著抗生素濃度越增加，抑制大腸桿菌生長(zhǎng)效果越明顯，所以Nyquist圖半徑越來(lái)越小，例如0.3 μL/mL對(duì)應(yīng)阻抗半徑約為250 Ω，0.1 μL/mL濃度下阻抗半徑約為400 Ω，而對(duì)照組未加抗生素的樣本阻抗半徑接近500 Ω。每組樣本間明顯的濃度梯度及對(duì)應(yīng)的阻抗梯度變化都為后期XGBoost機(jī)器學(xué)習(xí)分類(lèi)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.3 量化模型分析

為提高運(yùn)算效率，將擬合得到的7個(gè)參數(shù)投影到4個(gè)主要維度上后用作機(jī)器學(xué)習(xí)模型的輸入。將不同濃度下記錄的400組數(shù)據(jù)輸入到PCA算法中，不同參數(shù)數(shù)量的貢獻(xiàn)如圖6所示，根據(jù)選取信息量前90%的原則選取前4個(gè)主要參數(shù)Rs、CPE-T、CPE-P和R1。

圖6 通過(guò)主成分分析按90%的原則選取前4個(gè)參數(shù)為機(jī)器學(xué)習(xí)的輸入Fig.6 The first four parameters were selected as the input of machine learning according to the principle of 90% through principal component analysis

2.4 大腸桿菌菌液濃度預(yù)測(cè)模型結(jié)果

2.4.1參數(shù)優(yōu)化結(jié)果分析

圖7(a)顯示了XGBoost在參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中損失函數(shù)的變化。由圖中可以發(fā)現(xiàn)，損失函數(shù)(即目標(biāo)函數(shù))隨著迭代次數(shù)增加而逐漸減小，經(jīng)過(guò)40次左右迭代后，目標(biāo)函數(shù)已經(jīng)沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明

圖7 預(yù)測(cè)結(jié)果。(a)參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中損失函數(shù)和RMSE的變化；(b)XGBoost和SVM預(yù)測(cè)大腸桿菌5種菌液濃度結(jié)果對(duì)比；(c)XGBoost預(yù)測(cè)5種菌液濃度及2個(gè)盲濃度盒型圖(箭頭所示)；(d)XGBoost預(yù)測(cè)3種抗生素濃度結(jié)果Fig.7 Forecast results. (a) Changes in loss function and RMSE during parameter optimization; (b) Comparison of the results of XGBoost and SVM in predicting the concentrations of five strains of E. coli; (c) Box plots of XGBoost′s prediction of the concentrations of five strains and two blind concentration; (d) Figure of XGBoost′s prediction of three antibiotic concentration

40次迭代模型基本已經(jīng)趨于穩(wěn)定。圖中右邊兩條曲線(xiàn)顯示參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中訓(xùn)練集和測(cè)試集的均方根誤差變化。模型的損失函數(shù)隨著迭代次數(shù)的增加而逐漸減小，在迭代50次左右時(shí)，均方根誤差達(dá)到最小，此時(shí)模型達(dá)到最佳效果。

2.4.2預(yù)測(cè)結(jié)果

XGBoost量化模型訓(xùn)練后經(jīng)過(guò)交叉驗(yàn)證對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，將不同濃度的大腸桿菌樣本擬合后的電化學(xué)阻抗參數(shù)測(cè)試集放入模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖7(b)為隨機(jī)抽取5種濃度(3.3×108、4.0×108、4.8×108、5.8×108、9.4×108CFU/mL)的30組預(yù)測(cè)結(jié)果，整體上，預(yù)測(cè)結(jié)果比較穩(wěn)定且擬合較好。同時(shí)，將同一批數(shù)據(jù)集放入支持向量機(jī)模型中訓(xùn)練得到預(yù)測(cè)結(jié)果。圖7(b)中綠色數(shù)據(jù)點(diǎn)為SVM模型預(yù)測(cè)的結(jié)果，與XGBoost預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比可看出，XGBoost模型預(yù)測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

為驗(yàn)證XGBoost模型在基于非線(xiàn)性大批量電化學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)菌液濃度下的可行性及準(zhǔn)確率，隨機(jī)抽取10組(每組50個(gè)樣本)的菌液濃度預(yù)測(cè)結(jié)果，依據(jù)殘差和RMSE回歸評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。10組數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)殘差為(1.59±0.57)×10-3lg CFU/mL，且最大殘差僅為5.68×10-3lg CFU/mL；均方根誤差(RMSE)為(2.18±0.77)×10-3lg CFU/mL。每組數(shù)據(jù)均取得了較好的預(yù)測(cè)效果。

表1 隨機(jī)抽取10組預(yù)測(cè)結(jié)果的殘差和均方根誤差Tab.1 Residuals and RMSE of ten prediction results which were randomly selected (n=10)

為了更直觀(guān)地觀(guān)察XGBoost模型預(yù)測(cè)效果，將預(yù)測(cè)結(jié)果采用盒型圖方式進(jìn)行分析(見(jiàn)圖7(c))。比較不同濃度大腸桿菌樣本的檢測(cè)效果，在濃度3.3×108～9.4×108CFU/mL范圍內(nèi)，各濃度下的樣本預(yù)測(cè)值和實(shí)際值基本吻合，且線(xiàn)性良好，各組預(yù)測(cè)濃度最大上下限差值在1.49×107CFU/mL內(nèi)。在較低濃度3.3×108CFU/mL和較高濃度9.4×108CFU/mL時(shí)的回歸效果相對(duì)較好，但4.0×108～5.8×108CFU/mL等3組濃度預(yù)測(cè)誤差較大，尤其是4.0×108CFU/mL濃度。這是由于濃度樣本差別不大，且阻抗測(cè)試數(shù)據(jù)采集過(guò)程中存在一定系統(tǒng)誤差，因此對(duì)于濃度差較小的樣本，EIS數(shù)據(jù)特征不顯著造成的。結(jié)果表明，在高濃度和低濃度，即濃度差顯著時(shí)的預(yù)測(cè)結(jié)果有更好的分類(lèi)性。在圖7(c)中，對(duì)選取的5組濃度樣本進(jìn)行了濃度實(shí)驗(yàn)和預(yù)測(cè)結(jié)果的綜合比較，說(shuō)明了以上結(jié)果。同時(shí)，為了證明XGBoost模型對(duì)于預(yù)測(cè)未訓(xùn)練的大腸桿菌盲濃度有效，采集兩組未進(jìn)行訓(xùn)練的大腸桿菌濃度(4.5×108和7.5×108CFU/mL)下的EIS數(shù)據(jù)，將其輸入XGBoost模型進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7(c)箭頭標(biāo)示，也具有較好的分類(lèi)效果。實(shí)驗(yàn)表明，基于XGBoost建立的量化模型可較高準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)大腸桿菌濃度，基于此，將該模型應(yīng)用于對(duì)加入抗生素后的標(biāo)準(zhǔn)濃度大腸桿菌菌液樣本進(jìn)行電化學(xué)交流阻抗檢測(cè)，通過(guò)大腸桿菌在電極上的阻抗變化間接預(yù)測(cè)抗生素含量。

2.5 抗生素濃度預(yù)測(cè)模型結(jié)果

基于上文經(jīng)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果良好的XGBoost模型，建立了抗生素濃度預(yù)測(cè)模型，從3個(gè)抗生素濃度(0.1、0.2、0.3 μL/mL)中分別隨機(jī)抽取5組(每組30個(gè)樣本)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示，分析15組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)殘差以及均方根誤差RMSE，3個(gè)抗生素濃度各對(duì)應(yīng)的5組數(shù)據(jù)的平均殘差分別為4.50×10-3、7.26×10-3、5.67×10-3μL/mL，RMSE分別為6.46×10-3、8.85×10-3、7.05×10-3μL/mL，15組數(shù)據(jù)的RMSE為(7.45±0.73)×10-3μL/mL。

表2 隨機(jī)抽取3 h時(shí)3個(gè)抗生素濃度各5次預(yù)測(cè)結(jié)果的殘差和均方根誤差Tab.2 Residuals and root mean square errors of five predictions of three antibiotic concentrations at 3 h which were randomly selected

對(duì)比圖5(c)可知，初加入抗生素時(shí)，抑菌效果還不明顯，但同時(shí)刻下菌液濃度變化隨加藥濃度作用而逐漸明顯。加藥后2 h的OD600值與剛加入抗生素時(shí)對(duì)比，此時(shí)因抗生素作用效果開(kāi)始顯著，細(xì)菌生長(zhǎng)速度被抑制，隨藥物作用時(shí)間的變化，3組樣本對(duì)應(yīng)的菌液濃度梯度差會(huì)更明顯，從而會(huì)對(duì)回歸分類(lèi)效果造成影響。但根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加藥1 h后仍可實(shí)現(xiàn)3個(gè)藥物濃度的快速分類(lèi)。由圖7(d)所示，3種濃度作用下的標(biāo)準(zhǔn)菌液培養(yǎng)至3 h時(shí)的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際抗生素濃度對(duì)比圖可看出，相比于菌液濃度預(yù)測(cè)模型，抗生素預(yù)測(cè)模型雖誤差較大，但回歸精度均達(dá)0.01 μL/mL，仍符合預(yù)期回歸效果。

3 討論

電化學(xué)免疫分析法利用特異性反應(yīng)，具備高靈敏性、快速高效、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微量生物檢測(cè)，其技術(shù)關(guān)鍵在于如何將待測(cè)物體固定于電極界面。納米顆粒具有良好的生物兼容性、表面活性位點(diǎn)多、加快電子傳遞速率等特性常作為載體固定敏感分子，適用于生物化學(xué)分析檢測(cè)[25]。申建忠[26]通過(guò)合成二氧化硅包金納米棒多組分納米材料結(jié)合抗體等3種納米復(fù)合材料制備方法，以放大信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品中的大腸桿菌高靈敏度快速檢測(cè)。賈飛等[27]通過(guò)制備還原氧化石墨烯/碳納米管/納米金復(fù)合材料，構(gòu)建阻抗型電化學(xué)適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的定量檢測(cè)。目前的研究中，基于納米材料自組裝的復(fù)合材料電化學(xué)免疫檢測(cè)法雖靈敏度極大提高，但其制備過(guò)程繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不太適用于快速檢測(cè)場(chǎng)景。

針對(duì)傳統(tǒng)自組裝納米材料方法(如普魯士藍(lán)-多壁碳納米管-納米金復(fù)合材料)存在的問(wèn)題，利用電化學(xué)阻抗檢測(cè)法的高精度，免疫層析法的高結(jié)合力以及可快速重復(fù)操作的便捷性，將兩者結(jié)合在一起，以NC膜為介質(zhì)，構(gòu)建大腸桿菌-納米金-抗體-NC膜電極，實(shí)現(xiàn)大批量大腸桿菌濃度快速檢測(cè)[28]。蘇敬等[29]也曾利用NC膜良好的特性，基于ELISA競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，采用電泳方法將完全抗原固定在修飾NC膜的金電極上，以構(gòu)建快速檢測(cè)氯霉素電化學(xué)免疫傳感器。免疫層析法具有便捷，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于快速定性檢測(cè)，精度不高的場(chǎng)合，硝酸纖維素膜(NC膜)對(duì)蛋白質(zhì)分子有極強(qiáng)的非層析法的轉(zhuǎn)移介質(zhì)。結(jié)合圖7的預(yù)測(cè)結(jié)果，說(shuō)明使用NC膜作為固定待測(cè)物基底的電化學(xué)檢測(cè)方法具較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸附特性，可較牢固固定待測(cè)物，既簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)方法中繁雜的前期準(zhǔn)備工作，又規(guī)避了固定材料脫落的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

基于遺傳算法的SVM模型和基于樹(shù)的XGBoost模型都是新興的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究基于電化學(xué)阻抗法采集到的阻抗數(shù)據(jù)具有樣本量大、影響因素多、數(shù)據(jù)復(fù)雜多樣、非線(xiàn)性等特點(diǎn)，所以選擇適合的模型非常重要。SVM是一種用于識(shí)別對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行明顯分類(lèi)的算法，采用二次規(guī)劃求解支持向量，模型較大，訓(xùn)練效率較低，因此SVM算法對(duì)大規(guī)模訓(xùn)練樣本難以實(shí)施。XGBoost是一個(gè)優(yōu)化的分布式梯度提升庫(kù)，通過(guò)在代價(jià)函數(shù)中加入了正則項(xiàng)，用于控制模型復(fù)雜度，且內(nèi)置交叉驗(yàn)證法，具有良好的可擴(kuò)展性，可以提供出色的預(yù)測(cè)[30]。電化學(xué)測(cè)試中受檢測(cè)溶液、電路、待測(cè)物等影響，相比于SVM算法，XGBoost更適用于電化學(xué)測(cè)試的非線(xiàn)性數(shù)據(jù)。

通過(guò)建立大腸桿菌-抗體-NC膜模型檢測(cè)大腸桿菌的交流阻抗，采用XGBoost量化模型預(yù)測(cè)菌液濃度，同時(shí)也將該模型應(yīng)用于預(yù)測(cè)抗生素濃度。該方法在同行業(yè)領(lǐng)域中易于實(shí)現(xiàn)，具有靈活性，并且預(yù)測(cè)菌液濃度平均均方根誤差(RMSE)為2.18×10-3lg CFU/mL，預(yù)測(cè)抗生素濃度平均均方根誤差(RMSE)為7.45×10-3μL/mL。這些表明了以基于菌液濃度變化的電化學(xué)參數(shù)為特征的XGBoost模型在大批量微生物檢測(cè)以及抗生素用量預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域的適用性。除此之外，所采用的XGBoost模型在盲濃度數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)上較為準(zhǔn)確，具有很大優(yōu)勢(shì)，對(duì)于未來(lái)針對(duì)不同的電極形狀、電極結(jié)構(gòu)下大腸桿菌的統(tǒng)一化濃度預(yù)測(cè)具有重要意義。雖然預(yù)測(cè)抗生素濃度誤差相對(duì)于直接菌液濃度預(yù)測(cè)較大，但預(yù)測(cè)精度仍可達(dá)0.01 μL/mL，符合預(yù)期效果。同時(shí)，可通過(guò)藥物作用時(shí)間的加長(zhǎng)對(duì)加入抗生素后的菌液持續(xù)檢測(cè)，根據(jù)抗生素作用時(shí)程趨勢(shì)實(shí)現(xiàn)較高精度的抗生素濃度預(yù)測(cè),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)公共環(huán)境下的低閾值水平抗生素對(duì)于食源性微生物長(zhǎng)時(shí)程模型作用效果評(píng)估，達(dá)到抑菌效果定量檢測(cè)和用量控制，為菌類(lèi)耐藥性長(zhǎng)時(shí)程研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

基于阻抗特征參數(shù)的XGBoost模型反映了大腸桿菌菌液濃度以及抗生素抑菌效果的預(yù)測(cè)量，該預(yù)測(cè)量證明電極在生物電化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的有效貼附界面，即當(dāng)電極表面被微量的蛋白質(zhì)和細(xì)菌等生物膜貼附后造成的不同狀態(tài)，都可在該模型中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)及機(jī)器學(xué)習(xí)評(píng)估，下一步可對(duì)細(xì)菌耐藥性的長(zhǎng)時(shí)程評(píng)估做進(jìn)一步的研究，從而助力公共環(huán)境下的抗生素對(duì)于食源性微生物長(zhǎng)時(shí)程模型作用效果評(píng)估。通過(guò)阻抗法和XGBoost模型預(yù)測(cè)相對(duì)應(yīng)的生物膜貼附界面的動(dòng)態(tài)變化及細(xì)菌濃度，為定量分析細(xì)菌在電極表面的培養(yǎng)及抑制分析提供更多依據(jù)。