海洋細菌來源幾丁質(zhì)酶的研究進展

張新月，張月琪，王鳳彪，王紀(jì)生，倪浩東，王致鵬

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109）

幾丁質(zhì)是海洋環(huán)境中含量最為豐富的可再生資源，每年有超過1011噸幾丁質(zhì)形成[1]。幾丁質(zhì)也是僅次于纖維素的第二大類天然高分子化合物。雖然在全球水生生物圈中幾丁質(zhì)總量很大，但在海洋沉積物中幾丁質(zhì)含量并沒有實質(zhì)性增加。因為幾丁質(zhì)顆粒一旦到達海底就會被細菌為主的海洋微生物產(chǎn)生的生物酶降解，以維持碳氮循環(huán)的平衡[2]。因此，幾丁質(zhì)降解細菌對海洋生態(tài)系統(tǒng)中幾丁質(zhì)的物質(zhì)循環(huán)起著重要作用。

這些細菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶（Chitinase），將長鏈幾丁質(zhì)水解為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，進而被微生物利用。迄今為止，已鑒定出30多種海洋細菌所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶[2-6]。另外，人們對海產(chǎn)品的需求量也日益增加，海產(chǎn)品加工所產(chǎn)生的貝類、魚鱗、蝦蟹等甲殼類廢物不斷積累。蝦蟹等甲殼類動物每年產(chǎn)生25～35億噸的幾丁質(zhì)廢物[7]，貝類加工所剩余廢物中幾丁質(zhì)占廢物干重的20%～58%[8]，廢物的產(chǎn)生與累積對環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[2]。同時，利用幾丁質(zhì)酶制備N-乙酰葡萄糖具有高效和低成本等優(yōu)點，具有工業(yè)上的應(yīng)用價值。本文著重介紹海洋中幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)和來源，幾丁質(zhì)酶的作用方式及分類，海洋細菌來源幾丁質(zhì)酶的催化特性及其在多領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 海洋中幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)和來源

幾丁質(zhì)（Chitin）是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（Nacetyl-D-glucosamine, GlcNAc）通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性多糖[9]。幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與纖維素相似，如圖1[10]所示，當(dāng)C2位置上的R基為羥基時，是纖維素結(jié)構(gòu)式；當(dāng)C2位置上的R基為乙酰氨基時，是幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)式；當(dāng)乙酰氨基脫去乙酰基團連接一個氨基時，是殼聚糖結(jié)構(gòu)式。根據(jù)其來源，幾丁質(zhì)存在于α、β和γ三種形式，區(qū)別于多糖連接的取向，主要以α和β形式存在[11-12]。

圖1 幾丁質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecule structure of chitin

幾丁質(zhì)在自然界中分布廣泛，主要存在于蝦、蟹等甲殼動物、真菌及高等植物細胞壁、昆蟲腸道內(nèi)壁中。在海洋環(huán)境中，幾丁質(zhì)是由許多海洋生物，如軟體動物、原生動物、真菌和甲殼類動物等產(chǎn)生的最為豐富的復(fù)雜碳水化合聚合物[13]，大多存在于貝類、蟹蝦等甲殼類的外殼、頭足類的內(nèi)殼（魷魚的胃、烏賊的嘴部、胃粘膜以及軟骨）中[14]；在南極磷蝦殼中幾丁質(zhì)的含量約占整條磷蝦干重的4%[15]，新鮮的蝦頭約占整個蝦重的30%，具有豐富的甲殼資源；其次還存在于?？?、海兔、海鞘、海綿以及海泥中[16]。

海洋水產(chǎn)品生產(chǎn)和加工所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)廢棄物每年多達產(chǎn)25～35億噸。對于過多的幾丁質(zhì)廢物，解決該問題的最佳方法就是降解幾丁質(zhì)以生產(chǎn)幾丁寡糖等功能產(chǎn)品。這樣的方法不僅減少環(huán)境污染，而且具有工業(yè)價值。降解幾丁質(zhì)的方法包括化學(xué)法、物理法和酶法[17]?；瘜W(xué)法采用強酸和強堿進行，存在收率低，成本高和腐蝕性強等問題[18]。物理降解方法反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)穩(wěn)定性較差，產(chǎn)物不均一且有大量廢水產(chǎn)生，嚴(yán)重污染環(huán)境。而酶降解反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、對環(huán)境無污染，是新環(huán)境友好型的替代方法，是制備幾丁寡糖的重要技術(shù)[19]。

2 幾丁質(zhì)酶的作用方式和分類

幾丁質(zhì)酶是專一降解幾丁質(zhì)生成幾丁寡糖或單糖的一類酶的總稱[20]。它能將幾丁質(zhì)水解生成幾丁寡糖、幾丁二糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。如圖2所示，根據(jù)切割位點的不同，可將幾丁質(zhì)酶分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶沿聚合物內(nèi)部隨機位點切割生成幾丁寡糖，外切幾丁質(zhì)酶作用于糖鏈的非還原端將其切割成幾丁二糖，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶將內(nèi)切幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的寡糖分解為單體N-乙酰葡萄糖胺[9-10,21-22]，最終將其代謝生成所需能量。在幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用的過程中通常需要外切和內(nèi)切型的幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用，首先不溶性長鏈幾丁質(zhì)被切割為小短鏈，隨后通過N-乙酰氨基葡萄糖苷酶將乙酰殼多糖分解為N-乙酰葡萄糖胺[22]。

圖2 幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)示意圖Fig.2 Schematic diagram of chitinase hydrolysis of chitin

根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的多少，幾丁質(zhì)酶可以分為單催化結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶和多催化結(jié)構(gòu)域幾丁質(zhì)酶。根據(jù)酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列不同，幾丁質(zhì)酶分屬于18和19家族。第18家族幾丁質(zhì)酶主要包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物以及部分植物來源的幾丁質(zhì)酶，其中有記錄的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物細菌占有70%以上；第19家族主要存在于放線菌、霉菌以及大部分植物中[9-10]。大多數(shù)幾丁質(zhì)酶是模塊化的，除信號肽和催化結(jié)構(gòu)域外還包含輔助結(jié)構(gòu)域的蛋白，比如碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ChBDs）和纖連蛋白型結(jié)構(gòu)域（Fn-III）等。信號肽通常位于幾丁質(zhì)酶的N端，在幾丁質(zhì)酶向細胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)運和外部幾丁質(zhì)的利用中起著重要作用；ChBDs能夠促進酶與底物的結(jié)合，但不具有催化活性，因而ChBDs的缺失不影響酶降解幾丁質(zhì)的活性；Fn-III是一種糖蛋白，除了充當(dāng)其他結(jié)構(gòu)域之間的連接外，還可能引起酶與細胞外基質(zhì)的粘附[23]。而在某些多催化域幾丁質(zhì)酶之中，兩個催化域之間的氨基酸序列同源性通常較低，并且兩個催化結(jié)構(gòu)域彼此具有的特征[24]。

3 海洋細菌來源幾丁質(zhì)酶的催化性質(zhì)

近年來，科研工作者已經(jīng)對幾丁質(zhì)酶進行了許多研究。因海洋中幾丁質(zhì)含量豐富，幾丁質(zhì)酶在海洋微生物中廣泛存在。其中海洋細菌中幾丁質(zhì)酶研究得最為廣泛，已經(jīng)鑒定出多種具有pH和溫度穩(wěn)定性以及良好催化特性的幾丁質(zhì)酶。與陸地來源幾丁質(zhì)酶相比，部分海洋幾丁質(zhì)酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性，具有更好的應(yīng)用潛力。在表1中，簡單概括了海洋細菌中幾丁質(zhì)酶的基本催化性質(zhì)[25-26]。

3.1 pH性質(zhì)

從表1中可以看出，大多數(shù)幾丁質(zhì)酶在堿性條件下表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。例如，從芽孢桿菌（Bacillussp. R2）中分離的幾丁質(zhì)酶R2在pH7.5時表現(xiàn)出最大活性，分別在pH7.0和8.0時保留其活性的57%和62%[31]；假交替單胞菌（Pseudoalteromonassp. DL-6）低溫幾丁質(zhì)酶ChiA在pH8.0時表現(xiàn)出最大活性，在pH10.0時保留其活性的70%，ChiC在pH9.0時表現(xiàn)出最大活性，在pH8.0～9.0時保留其活性的80%[28]；在粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分離的幾丁質(zhì)酶rCHI-2，在37 ℃，pH9.0時孵育1 h后能保持90%以上活性[34]；Pseudoalteromonassp.DL-06在pH 7.0時表現(xiàn)最大活性，而在pH12.0還有48%的酶活力[38]。

表1 不同海洋幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的生化和酶學(xué)特性Table 1 Biochemical and enzymatic characteristics of different marine chitinase-producing bacteria

從表1中的最適pH范圍一列進行各種海洋幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌酶學(xué)性質(zhì)的總結(jié)，得出如圖3所示結(jié)果，最佳pH范圍介于類芽孢桿菌（Paenicibacillus barengoltziiCAU904）的3.5至Serratia marcescensG3-1的9.0之間。其中，海洋細菌Bacillussp. R2和交替假單胞菌（Pseudoal teromonas tunicataCCUG 44952T）在弱堿（pH7.5）環(huán)境下具有最佳活性；Pseudoal teromonassp. DL-6（ChiA）、鏈霉菌（Streptomycessp. DA11）、B-25在pH8.0具有最大活性，其余大部分都是在堿性環(huán)境下保持較高的降解能力，研究表明[31-33,35]，大多數(shù)海洋細菌幾丁質(zhì)酶在堿性pH并接近于海水pH時具有最大活性，但也會有少數(shù)的海洋細菌Paenicibacillus barengoltziiCAU904、芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii）、弧菌（Vibriosp.GR52）、橄欖鏈霉菌（Streptomyces olivaceusFXJ7.023）在酸性條件下表現(xiàn)最大活性。因此在堿性條件的培養(yǎng)下，源自海洋的幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出最大活性是非常合理的。

圖3 不同海洋幾丁質(zhì)酶活性的最佳pH比較Fig.3 Comparison of optimum pH for maximal activity of various marine chitinase-producing bacteria

3.2 溫度性質(zhì)

此外，熱穩(wěn)定性是工業(yè)應(yīng)用中最重要標(biāo)準(zhǔn)之一，部分幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。如Bacillussp.R2的幾丁質(zhì)酶在40 ℃時表現(xiàn)出最大活性，分別在50和60 ℃孵育30 min后仍保留50%和30%活性；Pseudoal teromonassp. DL-6低溫幾丁質(zhì)酶中，ChiA在30 ℃孵育1 h后仍保留80%以上活性，ChiC在50 ℃孵育1 h后仍保留70%以上活性；在Serratia marcescensrCHI-2中分離的幾丁質(zhì)酶在55 ℃時表現(xiàn)出最大活性，在45 ℃孵育1 h后仍保留85%活性；Paenicibacillus barengoltziiCAU904在60 ℃時表現(xiàn)出最大活性;Pseudoal teromonassp.DL-06在低溫15 ℃具最大活性，在60 ℃具有孵育1 h后仍保留50%活性。

從表1中的最適溫度范圍一列進行各種海洋幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌酶學(xué)性質(zhì)的總結(jié)，得到如圖4結(jié)果顯示，最佳溫度范圍介于Pseudoal teromonassp. DL-06的15 ℃至Paenicibacillus barengoltziiCAU904的60 ℃之間。這項研究表明，各種幾丁質(zhì)酶的最佳溫度范圍維持在15～60 ℃，大多數(shù)幾丁質(zhì)酶的最佳溫度均高于30 ℃，除了陳立功等[28]、王曉輝等[38]研究的Pseudoal teromonassp. DL-6 分別在20、15 ℃具有最佳活性。具有熱穩(wěn)定性的幾丁質(zhì)酶更有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，不會受到溫度的限制，從而減少工業(yè)化過程，降低成本。

圖4 不同海洋幾丁質(zhì)酶活性的最佳溫度比較Fig.4 Comparison of optimum temperature for maximal activity of various marine chitinase-producing bacteria

3.3 金屬離子對幾丁質(zhì)酶的影響

據(jù)報道，K+、Na+、Ca2+、Mg2+等金屬陽離子可以提高酶活性，而Ag+、Hg2+、Ba2+、Co2+、Cr2+和Cd2+等重金屬陽離子則有抑制作用[6,33-34,40]。例如Mn2+在Bacillussp. R2中被稱為激活因子，而在Pseudoal teromonassp. DC14和Vibriosp. GR52被認(rèn)為是幾丁質(zhì)酶的抑制因子；Cu2+對Vibriosp. GR52和Streptomycessp. DA11具有激活作用，對Bacillussp. R2和Serratia marcescensG3-1具有抑制作用，對Pseudoal teromonas tunicataCCUG 44952T具有完全抑制作用，而對Paenicibacillus barengoltziiCAU904卻沒有影響。

在Han 等[6]、鄭家敏等[29]的研究過程中除了進行金屬離子對幾丁質(zhì)酶的影響之外還發(fā)現(xiàn)SDS對幾丁質(zhì)酶的活性有明顯抑制作用；在Fu等[27]研究中發(fā)現(xiàn)SDS和EDTA對Bacillussp. R2沒有影響。這就表明相同金屬離子或相同溶液在不同菌屬中的作用效果大不相同，這也許和酶的構(gòu)象變化有著密切關(guān)系。

3.4 其他催化特性

最大反應(yīng)速率Vmax和Michaelis-Menten constant(Km)是最重要的酶動力學(xué)參數(shù)。它們是根據(jù)Lineweaver-Burk法計算得出的，用于指導(dǎo)研究和工程設(shè)計。Km量越小，它對底物的親和力越高，酶越靈活，它達到Vmax的速度就越快。表1給出了多種酶在最佳溫度和pH條件下的Vmax和Km，Bacillussp.R2在Km為6.97時具有Vmax=69.63 (U/mL)；Paenibacillus barengoltzii以殼聚糖為底物是在Km為7.91時具有Vmax=21.8 μmol/(min/mg)。

除此之外，各種純化的幾丁質(zhì)酶分子量也是重要生化特性之一。在本文引用的大多數(shù)研究中，SDS-PAGE的分子量都已估算出來。來自不同海洋細菌的幾丁質(zhì)酶分子量介于Streptomycessp. DA11的34 kDa和Pseudoal teromonassp. DL-6（ChiA）的110 kDa之間，在研究的所有報告中，孤立的幾丁質(zhì)酶均以單條帶出現(xiàn)，這表明它們是單體酶。

4 幾丁質(zhì)酶及其產(chǎn)物的應(yīng)用

海洋為新型化合物提供了豐富資源，在酶制劑方面具有潛在市場價值，近年來由于工業(yè)酶的易于培養(yǎng)和生產(chǎn)等優(yōu)點，尤其是對海洋微生物來源的酶的需求，對它們的應(yīng)用日益增加[41]。通過幾丁質(zhì)酶處理制備多種幾丁寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖及其各類衍生物, 具有抗真菌活性[21]、抗腫瘤活性[42]及促進有益微生物生長等作用，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域[43-44]。

4.1 在農(nóng)業(yè)與生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用

幾丁質(zhì)是真菌和昆蟲等生物體結(jié)構(gòu)中的主要成分，植物和高等生物中不含幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)破壞有害生物體結(jié)構(gòu)，而對農(nóng)作物不產(chǎn)生危害，因此可將這一特性應(yīng)用于病蟲害防治[45]。在未來幾年內(nèi)增加對幾丁質(zhì)酶的深刻研究，對其作為生物農(nóng)藥的潛力進行更系統(tǒng)分析，研究合適配方，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，在幾丁質(zhì)酶制劑與其他農(nóng)藥協(xié)同的作用下，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和持久性，真正發(fā)揮其功效，不斷提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量[44]。

幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶可以通過抑制病原菌孢子萌發(fā)及菌絲的生長來發(fā)揮防御作用，這一原理已成為研究熱點之一。例如，菌絲抑制試驗證明RmChi44[46]對植物病原真菌具有很強的抗性，包括炭疽菌（Colletotrichumsp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、鐮孢鐮刀菌（Fusarium solani）以及綠色木霉（Trichoderma viride）。Li等[21]從Corallococcussp. EGB中獲得的抗真菌幾丁質(zhì)酶對植物病原體米曲霉具有潛在抗真菌活性。Han等[6]研究的Streptomycessp. DA11所分離的出幾丁質(zhì)酶針對黑曲霉（Aspergillus niger）和白色念珠菌（Candida albicans）具有抗真菌能力。Brzezinska等[47]綜述了有關(guān)幾丁質(zhì)酶抑制真菌生長的能力，改善植物病原真菌介導(dǎo)的植物疾病的能力。利用微生物和病毒幾丁質(zhì)酶作為生物技術(shù)工具，控制和對抗真菌、昆蟲等植物病原體，可有效減少對農(nóng)作物的危害，表明幾丁質(zhì)酶可能具有控制疾病的潛在應(yīng)用。

4.2 在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

幾丁質(zhì)酶可對人體炎癥反應(yīng)起一定的生理作用，能夠用于一些疾病的監(jiān)控和診斷。幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)生成的幾丁寡糖具有提高機體免疫力、降血壓、降血脂、降血糖、抑制癌細胞生長、抗腫瘤等多種功能，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[48-50]。例如，Bussink等[51]實驗驗證人類幾丁質(zhì)酶AMCase具有免疫調(diào)節(jié)和水解幾丁質(zhì)的雙重功效，可用于哮喘病治療藥物的研發(fā)；殼六糖和殼庚糖具有抗腫瘤活性；酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶AMCase和殼三糖苷酶也可能與結(jié)膜炎，鼻息肉發(fā)病機制，腺樣體肥大，神經(jīng)脊髓炎和胃炎有關(guān)。

幾丁質(zhì)酶凝集素的生理功能尚未完全了解，但其似乎參與了不同的過程，例如組織重塑、受精和先天免疫，目前，已有研究指出，可以使用幾丁質(zhì)酶凝集素作為不同的疾病在評估階段、預(yù)后和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。例如，人幾丁質(zhì)酶3-樣蛋白1（CHI3L1）血漿水平可用于評估嚴(yán)重程度子癇前期、慢性子癇的預(yù)后心力衰竭、監(jiān)測治療反應(yīng)銀屑病[52]。Annamalai等[53]報道了從海鮮工業(yè)廢水中分離出的糞便AU02通過發(fā)酵海洋廢物顯示出抗氧化活性。研究結(jié)果表明，具有抗氧化活性的寡糖可被存在于體外培養(yǎng)上清液中的幾丁質(zhì)酶水解，因此海洋廢物可用于生產(chǎn)高附加值的成分，并且藥理研究可擴展其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途。

4.3 在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

氨基葡萄糖以及衍生物N-乙酰氨基葡萄糖可以作為營養(yǎng)補品，而且可以對某些真菌和細菌的生長起到抑制作用，因此可以作為食品中的保鮮劑或者抗菌劑[52]；幾丁寡糖進入人體內(nèi)并不會被胃酸分解，能夠有效防止人體吸收過多的熱量，可以預(yù)防肥胖癥、糖尿病的發(fā)生。Bhuvanachandra等[11]在CsChiL中得到一種具有轉(zhuǎn)糖基化活性的幾丁質(zhì)酶，可以用于制備食品工業(yè)中幾丁質(zhì)廢物生物轉(zhuǎn)化的雞尾酒。Hou等[43]通過用超聲的方法證實對幾丁質(zhì)降解的促進作用，相當(dāng)于提供一種用于功能性食品等生產(chǎn)的實用方法。此外，可以根據(jù)幾丁質(zhì)及其衍生物的降血糖、降血脂、延緩衰老、抗疲勞等作用制成具有相關(guān)功能的保健品。

5 結(jié)語

本文綜述了海洋細菌來源幾丁質(zhì)酶的作用方式、催化性質(zhì)和應(yīng)用。隨著幾丁質(zhì)酶研究的深入，海洋中巨量的幾丁質(zhì)資源受到越來越多的關(guān)注。從生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，幾丁質(zhì)酶為主的幾丁質(zhì)的降解過程能豐富海洋碳氮循環(huán)的理論。從工業(yè)應(yīng)用角度，多種海洋細菌來源幾丁質(zhì)酶的純化和鑒定為幾丁質(zhì)酶的工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)；為生產(chǎn)幾丁質(zhì)材料作為醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域提供了更廣闊的前景。幾丁質(zhì)酶有望成為一種新型的工業(yè)酶制劑。