染料木黃酮抑制AKR1C3抗去勢(shì)抵抗前列腺癌的生長(zhǎng)及其機(jī)制研究

陳 晉，伏天雨，劉 江，周恒平，孫永霞，陳思琪，艾 麗，朱彥鋒

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610500）

前列腺癌是中老年男性常見(jiàn)腫瘤之一，中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也逐年增加[1-2]。前列腺癌是一類(lèi)雄激素依賴(lài)性腫瘤[3]。早期發(fā)現(xiàn)雄激素剝奪治療（ADT）以降低睪酮水平能有效抑制前列腺癌的生長(zhǎng)，但后續(xù)證實(shí)，經(jīng)過(guò)ADT后，前列腺癌會(huì)發(fā)展成為去勢(shì)抵抗前列腺癌（CRPC），且患者生存期明顯降低[4-6]。因此，CRPC的防治是現(xiàn)今前列腺癌研究的重點(diǎn)[3,7]?，F(xiàn)階段，臨床上有很多化療藥、激素抑制劑、腫瘤疫苗用于治療CRPC[7-9]。但這些化學(xué)合成藥物治療后均帶來(lái)副作用。因此，尋找能夠用于治療CRPC的低毒性藥物，對(duì)于CRPC的臨床治療具有重要意義。

Aldo-keto還原酶家族1成員C3（AKR1C3）是一種類(lèi)固醇合成酶，是雄激素（T和DHT）合成最后兩步的關(guān)鍵酶[10-11]。前列腺癌作為一種雄激素依賴(lài)性的腫瘤，雄激素的含量變化對(duì)其生長(zhǎng)具有較大的影響[12]，文獻(xiàn)表明，在CRPC組織中AKR1C3 mRNA和蛋白水平均有上調(diào)，AKR1C3 siRNA能夠抑制AKR1C3 mRNA，進(jìn) 而 抑 制CRPC的 生 長(zhǎng)[13-14]。AKR1C3的異常表達(dá)不僅能對(duì)惡性腫瘤和內(nèi)分泌疾病產(chǎn)生影響，更與CRPC的惡性程度直接相關(guān)，是前列腺癌進(jìn)展成為CRPC的適應(yīng)性反應(yīng)[6,15-16]。近期研究發(fā)現(xiàn)，AKR1C3抑制劑在癌癥領(lǐng)域中的使用逐漸廣泛，對(duì)于抑制AKR1C3表達(dá)來(lái)降低雄激素合成的方式，可作為抗CRPC的新靶標(biāo)[17-18]。

染料木黃酮（GEN）作為一種高活性的天然植物雌激素，在大豆中的含量高于其他植物。GEN具有多種分子效應(yīng)，如抑制炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)甾體激素受體和代謝途徑[19]。有學(xué)者通過(guò)研究證實(shí)染料木黃酮不僅能影響癌細(xì)胞的增殖，也能減輕炎癥和脂肪的生成，預(yù)防肥胖和代謝綜合征[20-22]。所以GEN具有的多種分子效應(yīng)在預(yù)防和治療常見(jiàn)的疾病中發(fā)揮著重要的作用。

近年來(lái)，GEN被證實(shí)具有抑制CRPC細(xì)胞增殖的效應(yīng)[23]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。為探究GEN抑制AKR1C3的表達(dá)，繼而發(fā)揮抗去勢(shì)抵抗前列腺癌生長(zhǎng)的作用機(jī)制。本研究從雄激素合成途徑出發(fā)，擬通過(guò)膳食中最常見(jiàn)的大豆異黃酮活性單體GEN處理CRPC細(xì)胞，利用細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白印記及其他分子生物學(xué)技術(shù)方法，從體外探討GEN對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌增殖影響及GEN降低AKR1C3蛋白的表達(dá)，研究大豆異黃酮類(lèi)植物激素物質(zhì)抗去勢(shì)抵抗前列腺癌的新機(jī)制，為預(yù)防和治療去勢(shì)抵抗前列腺癌豐富理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人去勢(shì)抵抗前列腺癌22RV1細(xì)胞、人去勢(shì)抵抗前列腺癌VCaP細(xì)胞、正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基

中國(guó)上海；胎牛血清 美國(guó)Gibco；染料木黃酮干粉、AKR1C3抑制劑（ASP-9521） MCE（中國(guó)）；AKR1C3 siRNA 吉瑪基因（中國(guó)上海）；轉(zhuǎn)染試劑盒

賽默飛（美國(guó)）；CCK-8試劑盒、IP細(xì)胞裂解液碧云天（中國(guó)）；BCA蛋白定量試劑盒 Solarbio（中國(guó)上海）；PSA單抗、AKR1C3單抗（Abcam）；BACTIN單抗 中杉金橋。

電泳裝置 Bio-Rad（美國(guó)）；冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、凝膠成像儀 Thermo（美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)22RV1、VCaP和RWPE-1細(xì)胞株，22RV1用無(wú)酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%的活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清）培養(yǎng)，VCaP細(xì)胞用無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基（含10%的活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清）培養(yǎng)，RWPE-1用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清）培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的22RV1、VCaP細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)接種至6孔板底部，待密度長(zhǎng)至80%時(shí)更換培養(yǎng)液加入無(wú)酚紅RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，分別用5 μg的小干擾RNA，AKR1C3-homo-77、AKR1C3-homo-447和 AKR1C3-homo-1008與5 μL轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合處理，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h后在熒光顯微鏡下觀察NC孔，如有熒光且在細(xì)胞中分布均勻后，則將每孔用PBS潤(rùn)洗兩次后換DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后進(jìn)行細(xì)胞裂解并提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)[24]。如表1所示為AKR1C3 的siRNA引物序列。

表1 AKR1C3 的siRNA引物序列Table 1 siRNA primer sequences of AKR1C3

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的22RV1、VCaP和RWPE-1細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，次日用無(wú)菌PBS潤(rùn)洗后，加入（0、12.5、25、50、100）μmol/L的GEN工作液處理48 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加入工作液24、48、72 h 后，分別加入含CCK-8 的培養(yǎng)基100 μL孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度（OD），波長(zhǎng)設(shè)為450 nm[25]，按公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞活性（%）=（OD加藥-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100。

1.2.4 小干擾RNA和AKR1C3抑制劑對(duì)AKR1C3表達(dá)量的影響 為證實(shí)GEN抗去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞的增殖是通過(guò)抑制AKR1C3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，用AKR1C3 siRNA和AKR1C3抑制劑（ASP-9521）處理細(xì)胞，觀察二者的效果。體外培養(yǎng)22RV1、VCaP細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)接種至六孔板底部，待密度長(zhǎng)至80%時(shí)更換培養(yǎng)液，加入無(wú)酚紅RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，用最優(yōu)AKR1C3 siRNA 447進(jìn)行試驗(yàn)，使用5 μg AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合處理48 h。使用50 nmol/L AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合處理48 h，Western blot分析22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)[26]。

1.2.5 Western blot法檢測(cè) 用5個(gè)不同濃度（0、12.5、25、50、100）μmol/L GEN處理細(xì)胞48 h后，加入200 μL的IP裂解液，放置在冰上裂解30 min，在4 ℃下12500 r/min離心10 min，得到上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE凝膠，在80 V（濃縮膠）/120 V（分離膠）恒壓條件下分離蛋白質(zhì)，在250 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。PVDF膜用20 mL封閉液放置于常溫下封閉2 h，取出PVDF膜用1×TBST清洗3次，每次5 min，裁剪所需要條帶并放入相應(yīng)的一抗中，4 ℃封閉過(guò)夜。次日取出條帶，用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，再用二抗，室溫孵育90 min。用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，準(zhǔn)備化學(xué)發(fā)光成像[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GEN對(duì)CRPC細(xì)胞活力的抑制作用

GEN作為一種植物雌激素，能夠有效抑制去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞的增殖、抑制轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)凋亡[26-27]。研究結(jié)果顯示，GEN（50、100 μmol/L）處理后，能夠明顯抑制22RV1、VCaP細(xì)胞增殖（圖1A）。為進(jìn)一步研究GEN對(duì)CRPC細(xì)胞功能的影響，以Western blot測(cè)定PSA蛋白的表達(dá)。PSA作為前列腺癌治療的分子目標(biāo)，是因?yàn)槠洳粌H活躍在前列腺組織，在前列腺癌信號(hào)通路也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散、入侵、轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤微環(huán)境監(jiān)管等影響，因此血清中PSA水平與疾病進(jìn)展相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，GEN對(duì)RWPE-1細(xì)胞活力無(wú)顯著的抑制作用（P＞0.05），GEN（50、100 μmol/L）對(duì)PSA表達(dá)具有顯著抑制作用（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 染料木黃酮對(duì)22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3表達(dá)的抑制作用

研究表明，在前列腺癌轉(zhuǎn)化為CRPC的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生更多的睪酮，AKR1C3呈異常高表達(dá)，將導(dǎo)致更多具有活性的雄激素合成[29]，因此AKR1C3的異常表達(dá)可能是前列腺癌由激素依賴(lài)性向CRPC轉(zhuǎn)化的生物學(xué)標(biāo)志。結(jié)果顯示（圖2），GEN（25、50、100 μmol/L）處理后條帶灰度減弱，因此GEN（25、50、100 μmol/L）對(duì)AKR1C3表達(dá)具有明顯抑制效果。結(jié)合圖1結(jié)果，GEN處理后，GEN 50 μmol/L時(shí)首次出現(xiàn)能夠明顯抑制22RV1、VCaP細(xì)胞增殖及PSA表達(dá)的現(xiàn)象，因此選用GEN濃度為50 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 GEN對(duì)22RV1、VCaP細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of GEN on the proliferation ability of 22RV1 and VCaP cells

2.3 AKR1C3 siRNA447對(duì)22RV1、VCaP細(xì) 胞 中AKR1C3表達(dá)的抑制作用

圖3 結(jié)果顯示，綜合AKR1C3siRNA抑制22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3表達(dá)的結(jié)果，可以看出AKR1C3 siRNA447的條帶灰度減弱最明顯，因此AKR1C3 siRNA447對(duì)AKR1C3的抑制效果最為明顯。故選用AKR1C3 siRNA447進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 AKR1C3 siRNA抑制22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3表達(dá)的結(jié)果Fig.3 Inhibitory effect of AKR1C3 siRNA on AKR1C3 expression in 22RV1 and VCaP cells

2.4 AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）對(duì)22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3表達(dá)的抑制作用

如圖所示（圖4），與對(duì)照組相比，樣品組條帶灰度明顯低于對(duì)照組，且聯(lián)合使用時(shí)現(xiàn)象更為明顯。由此推斷，AKR1C3 siRNA447、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）對(duì)AKR1C3均有抑制作用，且AKR1C3 siRNA447和AKR1C3抑制劑（ASP-9521）分別與GEN（50 μmol/L）聯(lián)合作用時(shí)效果更強(qiáng)（圖5）。由此推測(cè)，GEN對(duì)AKR1C3的抑制機(jī)制與AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）抑制AKR1C3相似。類(lèi)似Pippione等[18]發(fā)現(xiàn)AKR1C3抑制劑可拮抗DHEA誘導(dǎo)的DuCaP生長(zhǎng)，以非選擇性的方式抑制AKR1C3的表達(dá)；以及Batra等[30]發(fā)現(xiàn)染料木素聯(lián)合多糖可抑制前列腺癌細(xì)胞內(nèi)雄激素的合成。

圖4 AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）聯(lián)合處理對(duì)22RV1、VCaP細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)的影響Fig.4 Effect of combined treatment of AKR1C3 inhibitor(ASP-9521) and GEN (50 μmol/L) on the expression of AKR1C3 in 22RV1 and VCaP cells

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通體外培養(yǎng)22RV1、VCaP、RWPE-1細(xì)胞，使用不同濃度的GEN處理48 h。利用CCK-8檢測(cè)22RV1、VCaP、RWPE-1細(xì)胞增殖活力。結(jié)果顯示GEN不抑制RWPE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，GEN（50、100 μmol/L）能明顯抑制22RV1、VCaP的生長(zhǎng)。后續(xù)Western blot檢測(cè)得出，GEN（50、100 μmol/L）濃度對(duì)前列腺癌標(biāo)志性抗原PSA蛋白和AKR1C3的表達(dá)均有抑制作用。由于AKR1C3是雄激素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，通過(guò)使用AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）分別與GEN單獨(dú)/聯(lián)合處理22RV1、VCaP細(xì)胞，推測(cè)GEN抗去勢(shì)抵抗前列腺癌的生長(zhǎng)是通過(guò)抑制AKR1C3的表達(dá)現(xiàn)實(shí)的。在前述實(shí)驗(yàn)中，GEN 50 μmol/L為首次出現(xiàn)抑制作用的濃度，所以選擇GEN 50 μmol/L處理后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot檢測(cè)AKR1C3的蛋白表達(dá)量，Western blot結(jié)果顯示，GEN 50 μmol/L能夠抑制細(xì)胞中AKR1C3蛋白的表達(dá)，且與AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)AKR1C3的抑制效果更為顯著。AKR1C3的抑制可延緩CRPC的發(fā)生、發(fā)展，增加患者的生存時(shí)間，為臨床上使用植物雌激素治療去勢(shì)前列腺癌的治療提供的新思路，研究結(jié)果為通過(guò)多食用豆制品預(yù)防前列腺癌提供了理論依據(jù)。