植物精油結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗采后的保鮮效果

龔晟蘭，楊治華，吳富敏，甘 維，徐振鑫

（湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，湖南常德 415000）

板栗（Castanea mollissimaBlume）為殼斗科（Fagaceae）栗屬（CastaneeMill.）植物。板栗是我國著名的干果，也是重要的木本糧食，在我國的種植歷史逾3000年[1]。板栗的營養(yǎng)價值高，且具補(bǔ)腎益氣、養(yǎng)胃健脾功效[2-3]。板栗為具休眠特性的頑拗性種子。采后的板栗易失水，且對失水敏感性強(qiáng)，失水不僅影響其保存性，也會影響其質(zhì)構(gòu)特性[4]。板栗采后生理代謝旺盛，極易受病原微生物的侵染而發(fā)生霉變[5]。在采后貯藏過程中，栗仁易出現(xiàn)呈白色粉末狀，即“石灰化”的生理病害[3]。因此，板栗是最難保藏的干果，我國每年板栗采后的損失率超過30%。

在自然狀態(tài)下板栗采后的呼吸非常旺盛，呼吸消耗很大，不利于板栗的中長期貯藏[6]。涂膜保鮮是常用的食品保鮮方法之一，利用涂膜材料在果蔬表面形成一層薄膜，可一定程度降低果蔬的呼吸強(qiáng)度和蒸騰失水速率，從而達(dá)到自發(fā)氣調(diào)保鮮和減少水分損失的目的[7-8]。王大紅等[9]將納他霉素復(fù)合防腐劑與普魯蘭多糖復(fù)合對板栗進(jìn)行涂膜保鮮，降低了板栗腐爛率，延長了保鮮期。

植物精油，又稱香精油、芳香油和揮發(fā)油，是存在于植物中的一類具芳香氣味、可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶的揮發(fā)性油狀成分的總稱，是植物的次生代謝產(chǎn)物。植物精油具有抑菌、驅(qū)/殺蟲、抗氧化等作用[10-14]。Nehal等[15]在對蠶豆根腐菌體外抑菌實驗中發(fā)現(xiàn)，2%（v/v）的檸檬草精油和百里香精油能完全抑制其生長。也有將植物精油與殼聚糖結(jié)合起來進(jìn)行果蔬保鮮研究的，如Panayiota等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，墨角蘭精油與殼聚糖結(jié)合使用可以降低鮮切萵苣在冷藏過程中的酵母與霉菌數(shù)。將殼聚糖與植物精油復(fù)合涂膜用于采后板栗的保鮮，尚未見相關(guān)研究報道。本實驗以湘栗四號板栗為試材，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，將不同植物精油復(fù)合，結(jié)合殼聚糖涂膜處理板栗，研究其對板栗采后石灰化、霉變腐爛及生理生化的影響，以期為板栗的采后保鮮提供新的技術(shù)路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山蒼子、肉桂、牛至、迷迭香 購于青島和本食品配料有限公司；山蒼子、肉桂、牛至和迷迭香精油

實驗室自制；湘栗四號板栗 采自湖南常德市，在板栗基地選取無機(jī)械損傷和病蟲害、成熟度一致（九成熟）的果實，采后立即運(yùn)回實驗室，在0～4 ℃下預(yù)冷24 h后備用；殼聚糖（食品級，脫乙酰度＞92%）、抗壞血酸、2,6-二氯酚靛酚 上海國藥集團(tuán)。

R4i型臺式高速冷凍離心機(jī) 法國Jouan公司；AL240型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Lamda-25紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；JY92-11超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JB揮發(fā)油提取器常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物精油的提取及板栗的處理 在實驗室采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取植物精油，方法如下：將山蒼子、肉桂、牛至和迷迭香按質(zhì)量添加2倍（v/m）蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)設(shè)7000 r/min處理12 min，然后用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)處理，功率為300 w，料液比為1:9（m/v），時間為30 min，最后用JB揮發(fā)油提取器水蒸氣蒸餾6.0 h，得到山蒼子、肉桂、牛至和迷迭香精油。

板栗的處理：制備1.5%（w/v）的殼聚糖涂膜液備用，其濃度依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果并參考文獻(xiàn)[5]。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，將山蒼子精油、肉桂精油、牛至、迷迭香精油按1:1:1:1（v/v）配制成復(fù)合精油備用。對照：板栗用超純水浸泡1 min后，撈出晾干。殼聚糖涂膜處理（處理1）：用1.5%的殼聚糖涂膜液浸泡板栗1 min后，撈出晾干。復(fù)合植物精油處理（處理2）：將45.0 g/L的聚氧乙烯蓖麻油30（Cremophor EL30）溶液與無水乙醇按1:2（v/v）制成復(fù)合表面活性劑，將前述復(fù)合表面活性劑、上述復(fù)合植物精油與超純水按照1:1:98（v/v/v）混勻后，用其浸泡板栗1 min，撈出晾干。復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜（處理3）：在處理2的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行殼聚糖涂膜處理，方法同處理1。對照和3個處理的板栗用量約為10 kg，均設(shè)3次重復(fù)，用塑料網(wǎng)兜盛裝后放在擱物架上，置于（0±1）℃、RH85%～90%的環(huán)境下貯藏，而用于害蟲防控效果試驗的板栗則在室溫條件下（溫濕度不恒定，未記錄）貯藏75 d。

1.2.2 指標(biāo)的測定

1.2.2.1 貯藏過程中板栗失重率的測定 采用稱重法，每30 d取樣一次，取樣量為500 g。

失重率（%）=[板栗初始質(zhì)量（g）-測定時質(zhì)量（g）]/板栗初始質(zhì)量（g）×100

1.2.2.2 貯藏過程中板栗霉變率、蟲果率及具商品價值的好果率的測定 霉變率測定每30 d取樣一次，蟲果率測定每15 d取樣一次，每次隨機(jī)取50粒板栗，剝掉栗殼及包衣，將栗仁對半切分后觀察，統(tǒng)計霉變、長蟲的板栗果數(shù)量。

霉變率（%）=霉變果數(shù)/取樣總果數(shù)×100

蟲果率（%）=長蟲果數(shù)/取樣總果數(shù)×100

貯藏至第150 d時，隨機(jī)取50粒板栗，剝掉栗殼及包膜，將栗仁對半切分后觀察，統(tǒng)計好果的數(shù)量，好果定義為無霉變、無蟲害、無異味的具有商品價值板栗果。

好果率（%）=好果數(shù)/取樣總果數(shù)×100

1.2.2.3 貯藏過程中板栗石灰化指數(shù)的測定 參考宋雯雯[17]的方法。每30 d取樣一次。隨機(jī)取50粒板栗從中間切開，計算其石灰化指數(shù)。石灰化指數(shù)計算依板栗仁石灰化面積劃分級別，無變化的為0級，＜20%為1級，20%～50%為2級，＞50%為3級。

石灰化指數(shù)=Σ（石灰化級別×該級果數(shù)）/（石灰化最高級別×總果數(shù)）×100

1.2.2.4 貯藏過程中板栗淀粉、VC含量的測定 板栗仁淀粉含量的測定：參照曹建康等[18]的方法，用酸水解法，每30 d取樣一次。取1.000 g板栗仁樣品，用80%乙醇水浴去可溶性糖，加蒸餾水煮沸糊化后用9.2 mol/L高氯酸提取，用3,5-二硝基水楊酸顯色，在540 nm波長下測吸光度后換算，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示。板栗仁VC含量的測定：采用2,6-二氯靛酚法，結(jié)果以每100 g板栗仁所含抗壞血酸毫克數(shù)表示[19]。

1.2.2.5 貯藏過程中板栗CAT、SOD活性的測定及MDA含量的測定 參考曹建康等[18]的方法。每30 d取樣一次。CAT活性測定采用分光光度法，取5.000 g板栗仁，研碎后用緩沖液提取、離心，得酶提取液，酶促反應(yīng)體系由2.9 mL濃度為20 mmol/L H2O2和100 μL酶提取液組成，在240 nm處測吸光度，每30 s記錄一次，以每分鐘吸光度減少0.01為1個酶活力單位（U），酶活性單位表示為U/mg。SOD活性測定用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法，取5.000 g板栗仁，獲得酶提取液的方法基本同CAT測定，將酶提取液、緩沖液、750 μmol/L NBT、20 μmol/L核黃素等混合，在560 nm處測定吸光度，以每分鐘每克樣品的反應(yīng)體系對NBT光還原的抑制為50%定義為1個SOD活力單位（U），酶活性單位表示為U/g。MDA含量的測定用硫代巴比妥酸（TBA）法，取1.000 g樣品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸后研磨、離心，得上清液，取2.0 mL上清液，加入同體積的0.67%TBA后煮沸，冷卻后離心，分別在450、532和600 nm處測定吸光度，反應(yīng)液中MDA的濃度c（mmol/L）=[6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450]÷1000，單位表示為mmol/g。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)的測定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用鄧肯多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗，0.05為顯著水平，0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗失重率的影響

采后板栗的失水與呼吸消耗是導(dǎo)致其失重的主要原因。貯藏期間板栗失重率的變化見圖1。由圖1可見，在整個貯藏過程中，對照組和各處理組的板栗失重率均呈上升趨勢，但對照組的失重率在第30 d時顯著高于3個處理組（P＜0.05），在第60 d及以后極顯著高于3個處理組（P＜0.01），說明殼聚糖涂膜對降低板栗重量損失具有極好的效果，而植物精油處理的效果雖不及殼聚糖涂膜，但仍展示了良好的作用，殼聚糖涂膜及精油處理后在板栗殼表面形成一層膜，其對板栗有兩重效應(yīng)，一是減少水分蒸騰散逸，二是降低呼吸強(qiáng)度，故能夠一定程度抑制板栗失重率的上升。3個處理中，處理1與處理3在貯藏的前120 d的差異不顯著（P＞0.05），第150 d時存在顯著差異（P＜0.05）；而處理2與處理1、3之間在第30 d和第60 d的差異不顯著（P＞0.05），至第90 d存在顯著差異，并延續(xù)至貯藏結(jié)束（P＜0.05）。至第150 d時，處理3、處理1和處理2的失重率分別為2.9%、3.1%和3.6%，而對照則高達(dá)11.9%。Luana等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)，殼聚糖涂膜對錐栗失重具有很好可見，采用復(fù)合植物精油處理結(jié)合1.5%殼聚糖涂膜是采后板栗控制失重的適宜方式。

圖1 貯藏過程中板栗失重率的變化Fig.1 Changes of weight-loss rate of chestnuts during storage

2.2 復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗霉變、蟲害及好果率的影響

貯藏過程中板栗霉變率與蟲果率的變化分別見圖2和圖3。由圖2可見，貯藏期間，對照組和各處理組的板栗霉變率均呈上升趨勢，但對照組的霉變率上升速度很快，在第30 d即極顯著高于3個處理組（P＜0.01），至貯藏結(jié)束時的霉變率達(dá)22.8%。而3個處理組雖然霉變率也在不斷升高，但幅度較對照組明顯要低，尤其是處理3，從第30 d至貯藏結(jié)束，其防霉效果均好于處理1和處理2（P＜0.05）。在第30和第60 d，處理2的霉變率均低于處理1（P＜0.05），但到第90 d，二者差異不明顯，這一趨勢維持至貯藏結(jié)束，這提示僅僅采用復(fù)合精油處理板栗，對貯藏前期的板栗防霉具有良好的效果，但隨著精油的不斷揮發(fā)，其防霉作用快速下降。殼聚糖涂膜具有抑制板栗霉變的效果，Luana等[20]將殼聚糖用于錐栗的涂膜保鮮，Huang等[21]將殼聚糖與乳清蛋白復(fù)合用于板栗涂膜保鮮，也發(fā)現(xiàn)了其良好的防霉作用，這與本文的研究結(jié)果有相似之處。而殼聚糖涂膜與復(fù)合精油處理結(jié)合起來的防霉效果則進(jìn)一步提示，殼聚糖成膜后對植物精油的裹覆作用，降低了后者的揮發(fā)性，有利于其防霉作用的持續(xù)發(fā)揮。

圖2 貯藏過程中板栗霉變率的變化Fig.2 Changes of molding rate of chestnuts during storage

圖3 貯藏過程中板栗蟲果率的變化Fig.3 Changes of pest rate of chestnuts during storage

由圖3可見，貯藏期間板栗蟲果率與霉變率的變化規(guī)律有很大不同，僅僅采用殼聚糖涂膜對防蟲沒有效果，在整個貯藏期間該處理與對照沒有顯著差異（P＞0.05），而處理2在第15、30 d都與處理3無明顯差異（P＞0.05），但在第45 d后差異顯現(xiàn)（P＜0.05），說明精油揮發(fā)殆盡，已喪失對蟲卵的抑制作用。而處理3則對抑制板栗中蟲卵生長具有極佳的效果，至第75 d，蟲果率僅為0.8%，在整個貯藏期間均維持在一個很低的水平。而本文的研究表明，復(fù)合植物精油具有防控采后板栗害蟲的良好作用，將植物精油處理與殼聚糖涂膜結(jié)合用于采后板栗蟲害防控實為可取的技術(shù)手段。

貯藏至第150 d時好果率測定結(jié)果見表1。表1的結(jié)果顯示，對照組的好果率明顯低于3個處理組，差異極顯著（P＜0.01）；而各處理組之間，處理3的好果率最高，平均值達(dá)到93%，處理1次之，處理2最低，三者之間存在顯著差異（P＜0.05），說明植物精油處理和殼聚糖涂膜處理均可顯著減緩采后板栗商品價值劣變的進(jìn)程，值得一提的是，二者結(jié)合使用具有疊加效應(yīng)。

表1 貯藏至第150 d時的好果率Table 1 Rate of chestnuts with commercial quality on 150th day

2.3 復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗淀粉含量與石灰化的影響

貯藏過程中板栗淀粉含量與石灰化指數(shù)的測定結(jié)果分別見圖4和圖5。由圖4可見，貯藏期間隨著板栗淀粉水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，對照組和各處理組的淀粉含量均呈下降趨勢，但對照下降速度明顯要快。第30 d時，對照與3個處理組即存在差異顯著（P＜0.05），而3個處理組間則無明顯差異（P＞0.05）。第60 d時，3個處理組間仍無顯著差異（P＞0.05）。第90 d及120 d時，三者的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。至第150 d時，處理3的淀粉含量仍為42.0%，僅較貯藏初始時下降7.7%，而處理1和處理2分別下降了14.1%和21.8%，處理3與處理1的差異顯著（P＜0.05），處理3與處理2的差異極顯著（P＜0.01）。這一結(jié)果說明，殼聚糖涂膜對抑制板栗呼吸酶系統(tǒng)的活性具有良好的作用，而植物精油也有一定的效果，二者結(jié)合使用的效果顯著。

圖4 貯藏過程中板栗淀粉含量的變化Fig.4 Changes of starch contents of chestnuts during storage

圖5 貯藏過程中板栗石灰化指數(shù)的變化Fig.5 Changes of calcification degrees of chestnuts during storage

貯藏過程中板栗石灰化指數(shù)的測定結(jié)果見圖5。由圖5可見，隨著貯藏時間的延長，即使在（0±1）℃、RH85%～90%下，對照組的石灰化率仍呈持續(xù)快速上升的趨勢，至150 d時達(dá)11.2%，對照組的石灰化率在整個貯藏期間始終高于各處理組，差異極顯著（P＜0.01）。3個處理組之間，在整個貯藏期，處理3的石灰化程度最低，處理1次之，處理2最高，每個測定時間點(diǎn)測定值的差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；至第150 d時，處理3的石灰化指數(shù)僅為3.0%。復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對采后板栗石灰化的影響與板栗淀粉含量的變化規(guī)律相同，說明板栗的石灰化程度與淀粉含量的下降高度相關(guān)。板栗貯藏過程中因失水而刺激淀粉酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致淀粉因不斷分解而減少，引起淀粉晶體結(jié)構(gòu)及理化性能的改變，這是導(dǎo)致板栗石灰化的關(guān)鍵誘因，與淀粉水解后產(chǎn)生的蔗糖含量無關(guān)[3]。顧采琴等[22]的研究認(rèn)為，高濕環(huán)境能有效抑制板栗石灰化的發(fā)生。本文的研究結(jié)果也提示，減少采后板栗蒸騰失水的技術(shù)手段可一定程度抑制其石灰化的發(fā)生。但也有研究認(rèn)為，除了失水，細(xì)胞壁的破壞也是引起板栗石灰化的主要原因[23]。

2.4 復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗仁VC含量的影響

貯藏過程中板栗VC含量的變化見圖6。由圖6可見，對照組與各處理組的VC含量在貯藏期間逐漸降低，對照的下降速度比各處理組要快，但在第30 d，差異不明顯（P＞0.05）。第60 d至試驗結(jié)束，對照組與各處理組之間均存在顯著差異（P＜0.05）。而3個處理組間，在第30、60 d時無差異（P＞0.05），第90 d時，處理1和處理2間無差異（P＞0.05），但處理3的VC含量則高于前兩者（P＜0.05），第120和150 d時，3個處理組間均存在差異（P＜0.05）。第150 d時，處理3的VC含量比初始時下降11.9%，而處理1為18.2%、處理2為25.0%?？梢姡参锞吞幚斫Y(jié)合殼聚糖涂膜，有利于抑制采后板栗VC的損失，其原因可能在于植物精油的抗氧化作用而減少了VC的氧化損失。Muzafary等[24]也發(fā)現(xiàn)，將殼聚糖與檸檬草精油或丁香精油結(jié)合處理柑橘，可有效減少其貯藏過程中VC的損失，這與本文的研究結(jié)果有相似之處。

圖6 貯藏過程中板栗仁Vc含量的變化Fig.6 Changes of Vc contents of chestnuts during storage

2.5 復(fù)合植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜對板栗仁CAT、SOD活性及MDA含量的影響

貯藏過程中板栗仁CAT和SOD活性的變化分別見圖7、圖8。由圖7可見，貯藏期間板栗的CAT活性呈逐漸下降趨勢，與各處理組相比，對照組的下降速度最快，在第30 d時即顯著低于各處理組（P＜0.05），至第150 d時差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。不同處理組的結(jié)果顯示，植物精油處理與殼聚糖涂膜均具有一定的抑制CAT活性下降的作用，二者結(jié)合使用具有一定的疊加效應(yīng)，3個處理組間在第30和60 d的差異不明顯（P＞0.05），第90 d時處理1與處理2之間仍無差異（P＞0.05），但處理2與處理3之間已有顯著差異（P＜0.05），第120 d和150 d時3個處理之間均存在顯著差異（P＜0.05）。

圖7 貯藏過程中板栗仁CAT活性的變化Fig.7 Changes of the activity of catalase of chestnuts during storage

圖8 貯藏過程中板栗仁SOD活性的變化Fig.8 Changes of the activity of superoxide dismutase of chestnuts during storage

SOD是植物體中專一清除超氧陰離子自由基的金屬蛋白酶。圖8顯示了采后板栗SOD活性與CAT活性基本一致的變化趨勢。這一結(jié)果提示，植物精油處理與殼聚糖涂膜能維持采后板栗的SOD與CAT在一個較高的活性水平，進(jìn)而維持了其較強(qiáng)的抗氧化能力。

貯藏過程中板栗MDA的變化情況見圖9。由圖9可見，MDA的變化趨勢與CAT和SOD活性變化趨勢則剛好相反，其原因在于后兩者一直維持較高的活性，故MDA的積累就少。徐鑫等[25]采用殼聚糖結(jié)合艾葉與石榴皮提取物對板栗進(jìn)行涂膜保鮮處理，也發(fā)現(xiàn)該處理能顯著降低MDA的積累。本文的研究結(jié)果證實，對中長期貯藏來說，植物精油處理結(jié)合殼聚糖涂膜有利于維持板栗在貯藏中后期較強(qiáng)的抗氧化能力，能有效降低膜脂過氧化程度，有利于維持板栗的商品品質(zhì)。江敏等[26]用殼聚糖-納米氧化鋅復(fù)合涂膜砂糖橘，周漢軍等[27]用桉葉精油處理砂糖橘，發(fā)現(xiàn)都能一定程度抑制砂糖橘SOD活性的下降，這與本文的研究結(jié)果有相似之處。本文將植物精油處理和殼聚糖涂膜用于板栗的保鮮，尤其是將二者結(jié)合起來使用，可有效減少水分的蒸騰散逸，維持板栗殼內(nèi)板栗仁所處微空間內(nèi)較高的相對濕度，這也從另一側(cè)面證實了顧采琴等[22]得出的高相對濕度（90%）比低相對濕度（50%）更有利于維持板栗CAT和SOD活性、減少M(fèi)DA積累的結(jié)論。

3 結(jié)論

1.5%殼聚糖涂膜對采后板栗保鮮的主要作用在于減少失水、抑制呼吸與石灰化，有一定的防霉效果，但作用有限。山蒼子精油、肉桂精油、牛至精油和迷迭香精油按1:1:1:1（v/v）的復(fù)合植物精油處理對采后板栗的防霉、防蟲與活性氧代謝調(diào)控的效果俱佳，但單獨(dú)使用易揮發(fā)，保鮮作用的持續(xù)性不好。而將復(fù)合植物精油浸果處理后再以殼聚糖涂膜，不僅后者可減緩前者的揮發(fā)，更重要的是二者可以做到優(yōu)勢互補(bǔ)，能有效減少貯藏過程中板栗的失重、抑制霉變與蟲害、減緩VC的消耗，能維持CAT與SOD的活性，抑制MDA的積累，且能有效抑制石灰化的進(jìn)程，對采后板栗的保鮮效果最佳，是一種極富前景的板栗采后保鮮技術(shù)手段。采后板栗石灰化產(chǎn)生的機(jī)制非常復(fù)雜，本文的研究也再次證實文獻(xiàn)已報道的失水及淀粉水解程度與石灰化程度的高度關(guān)聯(lián)性，但其具體分子機(jī)制仍不清楚，未來可借助代謝組學(xué)的方法對其展開系統(tǒng)性研究。