石榴花游離型和結(jié)合型多酚提取物抗氧化活性探究

楊 錕，車一鳴，黃斯琦，趙立鵬，羅 瑜

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

石榴花（Punica granatumL.）屬落葉灌木或小喬木石榴科石榴屬植物石榴的花，花蕾為紅色[1]。在《本草綱目》記有：“榴花主治：陰干為末，和鐵丹服，一年變白發(fā)如漆”。據(jù)相關文獻報道[2-6]，石榴花含豐富酚類、黃酮、鞣質(zhì)、糖類、色素和微量元素等成分，其粗提物具有較好的抗氧化、抗衰老、降血糖、降血壓、降血脂和抗動脈硬化等藥理作用。初夏時節(jié)，石榴種植戶一般在石榴花剛現(xiàn)蕾時去掉不能結(jié)實的鐘狀花，其后生長過程中大部分不能正常結(jié)果的花亦會自然脫落，因此，石榴花的可利用資源非常豐富。

目前國內(nèi)外的研究主要集中在石榴產(chǎn)品的加工與保健作用，石榴皮、籽、花提取物的抗氧化、抗病毒、抑菌、防癌、降血糖等作用[7-12]，也有對石榴花精油抗氧化能力、石榴花紅色素的提取分離、石榴花中葡萄糖苷酶抑制劑篩選等的研究[13-14]。目前針對石榴花中游離型和結(jié)合型多酚粗提物的提取測定和體外抗氧化活性研究較為少見。因此，本研究采用體外化學試劑法測定石榴花多酚粗提物的抗氧化能力，運用評價簡單、靈敏度較高的吸收過氧自由基能力法（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[15]，較為前沿、檢測迅速且對樣品中水溶性和脂溶性成分均能測定的清除過氧自由基能力法（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）[16]，還有常用的DPPH 自由基清除法（DPPH radical scavenging activity，DRSA）[17]、總氧自由基清除法（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）[18]和還原力能力法（reducing power，RP），通過測定可對石榴花兩種類型多酚粗提物的抗氧化活性進行一定評價，在一定程度上揭示石榴花多酚粗提物的抗氧化能力，對石榴花這一生物資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴花 來自云南蒙自某石榴種植場，收集自然掉落的完整石榴花，自然通風晾干，磨粉50目過篩，密封后置于-20 ℃冰箱保存，備用。

96孔黑色酶標板 美國Corning公司；水溶性維E（Trolox）標準品、2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、熒光素鈉鹽（FL） 美國Sigma試劑公司；沒食子酸標準品、水溶性維C標準品、2,2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（ABAP）、磷酸鹽緩沖溶液固體（PBS）、2,2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司；A360型紫外可見分光光度計翱藝儀器（上海）有限公司；Scientz-I8N型真空冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Synergy H4型全功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司（BioTek）。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴花多酚粗提物的制備 石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物的提取分別采用丙酮提取法和氫氧化鈉消化法，參照Adom等[15]、王立峰等[19]方法稍作修改。

1.2.1.1 游離型多酚粗提物的制備 取1 g磨碎的干燥石榴花，加20 mL 70%的丙酮溶液，超聲15 min后離心（4000 r/min，10 min）取上清液，殘渣用上述方法重復提取3次。收集全部上清液后于40 ℃條件下進行真空濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥得游離型多酚粗提物凍干粉，密封后于-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.1.2 結(jié)合型多酚粗提物的制備 用游離型多酚粗提物提取后的殘渣進行提取。殘渣中加入40 mL 4 mol/L氫氧化鈉溶液，避光消化4 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2，離心（4000 r/min，30 min），取上層清液加入乙醚、乙酸乙酯，以1:1:1比例進行萃取，取上層液保留，下層液重復萃取操作5次。合并所得全部上層萃取液后于40 ℃條件下進行真空濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥得結(jié)合型多酚粗提物凍干粉，密封后于-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.2 石榴花多酚粗提物多酚含量的測定 參照Adom、Chen等[20-21]的Folin-Ciocalteu法稍作修改。

1.2.2.1 標準曲線的建立 準確量取0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL容量瓶，各加入10 mL去離子水，再加入1.25 mL福林酚試劑，混勻靜置5 min，加入6.25 mL 10 %的碳酸鈉溶液，用去離子水定容。避光反應2 h，760 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

1.2.2.2 多酚含量的測定 將游離型和結(jié)合型多酚粗提物凍干粉分別配制成一定濃度溶液，取適量樣品液參照標準曲線方法進行測定。所得多酚含量以每克凍干粉量等同于沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/ g多酚干粉）表示。計算公式：

式中：C為帶入標準曲線計算得到的沒食子酸濃度，mg/mL；V為樣品液的體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

1.2.3 石榴花多酚粗提物體外抗氧化活性的測定

1.2.3.1 吸收過氧自由基能力（ORAC）測定 測定參照張怡一等[22]、李葦舟等[23]提及方法稍作修改。將試劑、標準品、待測樣品用（pH7.4，75 mmol/L）磷酸鹽緩沖液溶解。于96孔黑色酶標板中分別加入20 μL磷酸緩沖液（空白）、20 μL不同濃度的Trolox標準液和20 μL不同濃度的待測樣品液，將96孔黑色酶標板置于酶標儀中設定37 ℃溫育10 min，之后每孔加入0.96 μmol/L的熒光素（FL）工作液200 μL，再將酶標板置于酶標儀中設定37 ℃振蕩15 min，迅速加入119 mmol/L的ABAP工作液20 μL。設定全功能酶標儀的激發(fā)波長485 nm，入射波長535 nm，每5 min進行讀數(shù)，共2.5 h。采用近似積分法和以下公式計算熒光衰退曲線下熒光面積（area under the curve，AUC）：

式中：f1和fn表示第1次和第n次測定的相對熒光強度值；t間隔測定時間。

ORAC值以每克多酚干粉等同于Trolox的微摩爾數(shù)表示（μmol Trolox/g多酚干粉）。

1.2.3.2 清除過氧自由基能力（PSC）測定 參照Adom 等[16]、王立峰等[24]方法進行。DCFH反應液制備：取1 mmol/L氫氧化鉀溶液900 μL與2.48 mmol/L的DCFH-DA溶液 80 μL，混合避光水解5 min，用（pH7.4，75 mmol/L）磷酸緩沖液定容至6 mL備用。于96孔黑色酶標板中分別加入100 μL磷酸緩沖液（空白），100 μL不同濃度Trolox標準液和100 μL不同濃度樣品液，之后加入100 μL DCFH反應液，迅速加入50 μL 200 mmol/L的ABAP反應液。設定全功能酶標儀37 ℃，激發(fā)波長485 nm，入射波長538 nm，每2 min進行一次讀數(shù)，共40 min。

將試驗數(shù)據(jù)進行平均熒光值和熒光積累面積計算后作為計算抗氧化能力的基礎。根據(jù)公式進行計算：

式中：SA為樣品或標準品的熒光積累面積；CA為空白對照的熒光積累面積。

PSC單元對應著劑量-反應曲線，可從曲線圖中計算半數(shù)效應濃度EC50值（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。多酚樣品抗氧化能力用每毫克多酚干粉等同于Trolox的微克數(shù)表示（μg Trolox/mg多酚干粉）。

1.2.3.3 清除DPPH自由基能力（DRSA）測定 參考陳壁等[25]方法稍作調(diào)整。將石榴花多酚粗提物溶解稀釋成不同濃度，取各樣品0.5 mL，加入4 mL濃度約0.075 mmol/L的DPPH-甲醇工作液，混合避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度；設空白對照。同時以VC標準品作陽性對照。最終計算DPPH自由基清除率和各樣品IC50值。

式中：A空白為DPPH乙醇溶液吸光度；A樣品為樣品溶液吸光度。

1.2.3.4 清除ABTS+自由基能力（TEAC）測定 測定參照張紅城等[26]方法稍作調(diào)整。ABTS自由基工作液：88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液 和5 mL 7 mmol/L ABTS溶液混勻避光保存過夜，得ABTS自由基儲備液；使用前將ABTS自由基儲備液與無水乙醇按一定比例進行稀釋使用。將石榴花多酚粗提物溶解稀釋成不同濃度，取各待測樣品0.25 mL，加入4 mL ABTS自由基工作液，混勻靜置6 min，在734 nm處測定吸光度；設定空白對照。同時以VC標準品作為陽性對照。最終計算ABTS+自由基清除率和各樣品IC50值。

式中：A空白為ABTS陽離子工作液吸光度；A樣品為樣品溶液吸光度。

1.2.3.5 還原能力（RP）測定 測定參照文獻[25,27]等方法進行。將石榴花多酚粗提物用去離子水溶解并稀釋成不同濃度待測樣品，準確吸取0.4 mL不同濃度的待測樣品，分別加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和1 mL濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后置于50 ℃水浴保溫20 min，冷卻后加入1 mL濃度10%的三氯乙酸充分混勻后離心（4000 r/min，10 min）。離心后取上清液2 mL，加入1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，加去離子水定容，混勻靜置10 min后于700 nm處測定吸光值；設定空白對照。同時以VC標準品作為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計主要用SPSS 19.0，GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析，圖表利用Origin 2018進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴花多酚粗提物多酚含量測定結(jié)果

以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。標準曲線方程Y=156.11X+0.0042，R2=0.9993，說明沒食子酸（GAE）在0.000～0.006 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

將石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物凍干粉所測吸光度代入沒食子酸標準曲線方程，得到游離型和結(jié)合型樣品多酚含量分別為244.08±10.41 mg GAE/g游離型干粉，66.50±1.04 mg GAE/ g結(jié)合型干粉，游離型多酚含量明顯高于結(jié)合型。

2.2 石榴花多酚粗提物體外抗氧化測定結(jié)果與分析

2.2.1 吸收過氧自由基能力（ORAC）測定結(jié)果 在有熒光素探針（FL）存在的條件下，添加ABAP激發(fā)產(chǎn)生過氧自由基（ROO·），熒光素探針被破壞，熒光強度減弱，在有抗氧化劑的條件下，可以抑制熒光強度的衰減[21]。通過測定可得不同濃度抗氧化劑Trolox、游離型和結(jié)合型多酚粗提物熒光強度隨時間衰減的時間動力學與劑量反應曲線圖，由圖2A可知，Trolox濃度越高，熒光衰減速度越慢，熒光積累量越大。由圖2B可知，同一濃度兩種多酚粗提物具有不同熒光強度衰減趨勢，同一時間游離型樣品熒光積累量最大，熒光衰減速度最慢，其次為結(jié)合型樣品，最后為空白對照。以Trolox濃度為橫坐標，熒光衰退曲線下凈熒光面積（net AUC）為縱坐標，繪制Trolox系列標準品標準曲線2C，通過換算得兩種多酚粗提物ORAC值分別為870.77±14.90 μmol Trolox/g游離型干粉，470.10±39.84 μmol Trolox/g結(jié)合型干粉。ORAC值越大說明樣品吸收過氧自由基能力越強，游離型多酚粗提物ORAC值高于結(jié)合型多酚粗提物ORAC值，表明游離型多酚粗提物吸收過氧自由基能力強于結(jié)合型（P＜0.05）。

圖2 吸收過氧自由基能力測定結(jié)果Fig.2 Determination results of oxygen radical absorbance capacity

2.2.2 清除過氧自由基能力（PSC）測定結(jié)果 加入ABAP激發(fā)產(chǎn)生過氧自由基（ROO·）氧化非熒光二氯熒光素（DCFH）為熒光二氯熒光素（DCF），可對產(chǎn)生的熒光進行測定，通過添加能清除過氧自由基的抗氧化劑對DCFH的氧化進行控制[21]。通過測定可得不同濃度Trolox以及游離型和結(jié)合型樣品熒光強度隨時間遞增的時間動力學與劑量反應曲線圖3A～圖3C。由圖可知，不同濃度Trolox以及兩種樣品總體趨勢均隨時間推移其熒光積累量均逐漸遞增，但低濃度樣品熒光積累量遞增急劇，高濃度樣品熒光積累量遞增平緩；從曲線平緩程度可推測樣品清除過氧自由基能力，樣品濃度越高，曲線斜率越小，清除能力越強；反之，樣品濃度越低，曲線斜率越大，清除能力越弱。

通過熒光積累量可換算得PSC值，樣品濃度與PSC值構(gòu)成劑量反應曲線，見圖3D～圖3F。由圖可知不同濃度Trolox和多酚粗提物隨濃度變化產(chǎn)生不同PSC值，變化趨勢為低濃度樣品產(chǎn)生較大的熒光積累面積SA，較低的PSC值，高濃度樣品產(chǎn)生較小的熒光積累面積SA，較高的PSC值；但所有樣品到一定濃度后PSC值基本穩(wěn)定。從PSC單元構(gòu)成的劑量反應曲線進一步計算半數(shù)效應濃度EC50值，Trolox的EC50=9.52 μg/mL，游離型和結(jié)合型分別為EC50=32.47、83.94 μg/mL，兩種多酚粗提物能引起50%抑制所需要的量分別約為VC量的3.4倍和8.8倍，PSC值分別為290 μg trolox/mg游離型干粉，110 μg trolox/mg結(jié)合型干粉。EC50值越低，抗氧化能力越強，游離型多酚粗提物樣品抗氧化能力高于結(jié)合型多酚粗提物（P＜0.05）。

2.2.3 清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力測定結(jié)果 DPPH自由基溶液和ABTS+自由基溶液分別在517 nm和734 nm處有吸光度值，當向自由基溶液中加入待測樣品，若其吸光度值下降，則說明自由基濃度降低，待測樣品具有清除溶液中自由基的能力[5,13]。不同濃度VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物清除DPPH自由基和ABTS+自由基情況如圖4A～圖4C所示，由圖可知不同濃度的不同樣品均具有一定的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力，樣品濃度越高，清除率越強，清除率與樣品濃度呈良好的線性關系；但隨樣品濃度增加，自由基清除率先明顯上升后趨于平緩。

圖4 清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力測定結(jié)果Fig.4 Determination results of DPPH and ABTS+ free radical scavenging ability

在清除DPPH自由基測定中，當VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物分別達到40、70、350 μg/mL左右濃度時，清除率基本穩(wěn)定在80%左右；Kaur等將石榴花的乙醇提取物進行DPPH自由基清除能力測定，發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL濃度下清除率達81.6%[5]。通過曲線擬合得各樣品清除DPPH自由基的IC50值大小依次為：VC（IC50=22.75 μg/mL）＞游離型（IC50=34.56 μg/mL）＞結(jié)合型（IC50=170.1 μg/mL），游離型和結(jié)合型樣品抗氧化能力相當于VC的66%和13%。在清除ABTS+自由基測定中，當VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物濃度分別達到60、80、450 μg/mL時，清除率達到95%左右并趨于穩(wěn)定；通過曲線擬合得各樣品清除ABTS+自由基的IC50值大小依次為：VC（IC50=26.33 μg/mL）＞游離型（IC50=34.89 μg/mL）＞結(jié)合型（IC50=214.2 μg/mL），游離型和結(jié)合型樣品抗氧化能力相當于VC的75%和12%?？偟膩碚f，樣品無論對DPPH自由基還是ABTS+自由基均具有一定的清除作用，且清除效果與濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關。

2.2.4 還原力測定結(jié)果 樣品與還原力測定的試劑反應后，在700 nm處有吸光度值。若樣品抗氧化能力越強，則反應后溶液吸光度越大，可用吸光度來表示樣品的還原能力[27]。由圖5可知，不同濃度的VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物還原力在實驗濃度范圍內(nèi)都隨濃度增加而增強，線性擬合方程分別為：Y（VC）=0.0074X+0.013（R2=0.9987），Y（游離型）=0.0031X-0.0215（R2=0.9960），Y（結(jié)合型）=0.0004X+0.0024（R2=0.9978），有明顯的劑量效應關系。從圖5可知同一濃度VC、游離型和結(jié)合型樣品吸光度值差別顯著（P＜0.05），游離型和結(jié)合型樣品還原力顯著低于VC（P＜0.05），總體還原力大小為：VC＞游離型＞結(jié)合型。

圖5 還原能力測定結(jié)果Fig.5 Determination results of reducing capacity

3 結(jié)論

對石榴花中游離型和結(jié)合型多酚粗提物進行提取并進行多酚含量測定和抗氧化能力評價發(fā)現(xiàn)，游離型多酚粗提物多酚含量（244.08±10.41 mg GAE/g游離型干粉）顯著高于結(jié)合型多酚粗提物（66.50±1.04 mg GAE/g結(jié)合型干粉）（P＜0.05）；兩種多酚提取物吸收過氧自由基能力（ORAC）測定中，以Trolox作為陽性對照，Trolox和兩種多酚粗提物有明顯的熒光衰減動力學與劑量反應趨勢，ORAC值分別為870.77±14.90 μmol Trolox/g游離型干粉，470.10±39.84 μmol Trolox/g結(jié)合型干粉；清除過氧自由基能力（PSC）測定中，以Trolox作為陽性對照，Trolox和兩種多酚粗提物有明顯的熒光遞增動力學與劑量反應趨勢，有明顯的PSC單元反應劑量趨勢，EC50值分別為32.47和83.94 μg/mL，PSC值分別為290 μg Trolox/mg游離型干粉，110 μg Trolox /mg結(jié)合型干粉。清除DPPH自由基的IC50值分別為34.56和170.1 μg/mL，以VC作為陽性對照，其抗氧化能力相當于VC的66%和13%；清除ABTS+自由基的IC50值分別為34.89和214.2 μg/mL，以VC作為陽性對照，其抗氧化能力相當于VC的75%和12%；還原力表現(xiàn)均為樣品在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度的增加而增強。5項抗氧化活性指標測定中游離型多酚粗提物抗氧化能力均高于結(jié)合型（P＜0.05）。

本研究表明石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物均具有一定抗氧化作用，游離型抗氧化能力優(yōu)于結(jié)合型，與抗氧化劑Trolox和VC比較，抗氧化性稍弱，但作為天然抗氧化劑，具有一定研究價值，可為石榴花的深加工和應用提供新思路，也可為天然抗氧化劑的研究與開發(fā)奠定一定理論基礎。