富順香辣醬生產(chǎn)環(huán)境食源性致病細菌的分析及溯源分析

袁先鈴，張洲銪, ，袁玉梅，王俊丁，雷 鳴

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川自貢 643000；2.四川省遠達集團富順縣美樂食品有限公司，四川自貢 643200）

富順香辣醬是挑選優(yōu)質(zhì)原輔料經(jīng)過預(yù)處理、加工、醬體調(diào)配、殺菌、罐裝最后再進行包裝而成的半固態(tài)復(fù)合調(diào)味料[1]，屬于一種非發(fā)酵類辣椒醬，與發(fā)酵類辣椒醬不同，香辣醬通常與各種肉制品、蔬菜和食用菌等搭配形成不同風味的調(diào)味食品[2-4]。香辣醬具有濃郁鮮香、溫中健脾和增強食欲等特點[5-6]，暢銷全國，甚至出口到南非和日本等國家，近幾年的產(chǎn)值和銷售額也在不斷遞增。

食源性致病菌是誘發(fā)食品安全問題的重要隱患[7]，致病性細菌直接或間接污染產(chǎn)品，從而造成香辣醬出現(xiàn)變色、脹氣等腐敗現(xiàn)象，人感染后可導(dǎo)致腸道傳染病及食物中毒的發(fā)生并導(dǎo)致畜禽傳染病的流行[8-9]。劉洋等[10]研究發(fā)現(xiàn)辣椒醬在自然發(fā)酵前期的主要優(yōu)勢菌是腸桿菌屬；研究者Estrada-garcia等[11]對市售辣椒醬調(diào)查發(fā)現(xiàn)，5%的樣本含有大腸埃希氏菌（Escherichia coli）。因此對香辣醬生產(chǎn)過程中的食源性致病菌進行研究顯得尤為重要。

本研究以原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、罐裝車間、機器設(shè)備表面、生產(chǎn)人員等與香辣醬直接或間接的接觸環(huán)境為研究對象，以菌落總數(shù)、腸桿菌科菌為目標指示菌，通過對香辣醬生產(chǎn)環(huán)境進行動態(tài)監(jiān)控，確定腸桿菌科種類及其在生產(chǎn)過程中數(shù)量變化。對分離出食源性致病細菌，進行革蘭氏染色、氧化酶實驗、葡萄糖實驗等生理生化鑒定和分子生物技術(shù)鑒定，確定其種屬，并進行溯源分析，為香辣醬生產(chǎn)環(huán)境的污染情況風險控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富順香辣醬 采樣于四川省自貢市富順縣遠達集團美樂食品有限公司；平板計數(shù)瓊脂（PCA）、氧化鈉（分析純）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、糖瓊脂（VRBGA）、緩沖蛋白胨水（BPW）、營養(yǎng)瓊脂（NA） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

HX3002T電子天平 慈溪市天東衡器廠；LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；101-3AB電熱鼓風干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 杭州旭清科技有限公司；SHP-250E生化培養(yǎng)箱 上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；PH100-2A41L-EP生物顯微鏡 深圳市潤興光學(xué)儀器有限公司；3730XL測序儀 美國ABI公司；Legend Micro17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；2720 thermal cycler PCR儀美國ABI公司；JY300C電泳儀、電泳槽、JY04S-3C凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；DFD-700水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；L550板式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香辣醬生產(chǎn)工藝 富順香辣醬生產(chǎn)工藝主要分為以下四個階段：第一工段，原輔料的預(yù)處理，清選出各種雜質(zhì)；第二工段，原輔料加工及粉碎，包括醬油和菜油的萃??；第三工段，在調(diào)配缸中投入辣椒醬胚，投入萃取醬油、香辛料，攪拌均勻后，投入調(diào)配用萃取油，攪拌均勻；第四工段，殺菌、罐裝和包裝。

1.2.2 采樣方法

1.2.2.1 空氣取樣 將營養(yǎng)瓊脂（NA）平板和結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）平板放到采樣點，打開皿蓋，暴露5 min。采樣頻次，以每班次生產(chǎn)為周期，在生產(chǎn)前、生產(chǎn)過程中2 h/次、生產(chǎn)結(jié)束時分別采樣，檢測生產(chǎn)過程中菌落總數(shù)和腸桿菌現(xiàn)狀及變化趨勢。具體采樣點要求按GB/T 18204.3-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法》（第3部分：空氣微生物）進行操作：A：室內(nèi)面積大于50 m2以上的設(shè)置5個采樣點；B：采樣點按均勻分布原則將采樣的平板放置在生產(chǎn)線上；C：采樣點與地面距離1.2～1.5 m，與墻壁距離應(yīng)大于或等于1 m；D：應(yīng)避免將通風口、通風道等作為采樣點。

1.2.2.2 涂抹取樣 用經(jīng)殺菌后蘸有無菌生理鹽水棉球擦拭取樣框內(nèi)表面（框內(nèi)面積為50 cm2），擦完后將棉球放入盛有10 mL無菌生理鹽水的試管中，此試管中溶液每mL代表5 cm2，密封帶回微生物室備用[12]。

1.2.2.3 環(huán)境監(jiān)控點及采樣方式 環(huán)境監(jiān)控點為：原料庫房；粉碎車間；調(diào)配車間；罐裝車間；生產(chǎn)人員及機器設(shè)備。其中原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間和罐裝車間采用空氣采樣的方式，生產(chǎn)人員和機器設(shè)備采用涂抹取樣的方式。

1.2.3 菌落計數(shù)與空氣菌群密度的換算 先直接數(shù)出培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)目，再通過奧梅梁斯基公式（Omeilianski）將單位CFU/皿轉(zhuǎn)換為CFU/m3。奧梅梁斯基認為，在100 cm2表面積的培養(yǎng)皿上5 min內(nèi)沉降的菌群總數(shù)等同于10 L空氣內(nèi)的菌群總數(shù)[13]。

式中：X—每m3空氣中的細菌數(shù)，CFU/m3；N—培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，CFU /皿；r—培養(yǎng)皿半徑，cm。

1.2.4 環(huán)境監(jiān)控試驗方法 菌落總數(shù)：將采集細菌后的營養(yǎng)瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)[14]；腸桿菌科：將采集細菌后的結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落計數(shù)[15]。

1.2.5 生理生化鑒定 革蘭氏染色：依次對細菌進行涂菌、初染、媒染、脫色、復(fù)染，然后在顯微鏡下觀察菌落的顏色和形態(tài)并記錄；氧化酶實驗：用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取單個菌落涂于浸濕氧化酶試劑的濾紙上，若濾紙的顏色在10 s內(nèi)變成藍紫色，則判為陽性反應(yīng)，反之則為陰性；葡萄糖實驗：用接種針挑取少許氧化酶試驗結(jié)果為陰性的同一個菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內(nèi)，于36±1 ℃培養(yǎng)。24±2 h后，若試管內(nèi)的內(nèi)容物變?yōu)辄S色，則判為陽性反應(yīng)，反之則為陰性。

1.2.6 菌種鑒定 將經(jīng)過分離純化后保存的菌株送成都擎科公司進行16S rDNA分子測序；對獲得的序列 用NCBI（http://gffiy6dccdd7b6fe04693svubbvwq 6oop06n5n.fffb.suse.cwkeji.cn:999/）中的BLAST進行同源性比較[16]，從BLAST比對結(jié)果中找出最相似序列；結(jié)合生理生化實驗和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌的種。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析同源關(guān)系較近的菌株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析。采用Duncan法進行顯著性分析，結(jié)果表示為平均值±標準差。

模型構(gòu)建。根據(jù)以上分析，本文以碳排放數(shù)量為因變量，以碳交易金額和地區(qū)生產(chǎn)總值為自變量，建立二元線性回歸模型，方程如下

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

2.1.1 各生產(chǎn)車間腸桿菌科菌及菌落總數(shù)測定結(jié)果

生產(chǎn)過程中，對原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、罐裝車間菌落總數(shù)和腸桿菌科菌落數(shù)量變化進行監(jiān)測，測定結(jié)果如表1、表2所示。

由表1、表2相比可知，腸桿菌科疑似菌的菌群密度均遠小于菌落總數(shù)菌群密度；由表1可知，原料庫房每個時間段的菌落總數(shù)都達到了多不可記的程度，可能是原料庫房通風性好，人員流動也相對頻繁等原因所導(dǎo)致，并且原輔料進入原料庫房也會攜帶大量的菌，賀稚非等[17]研究發(fā)現(xiàn)辣椒表面優(yōu)勢菌是細菌，其達到了3.40×107CFU/g。粉碎車間與調(diào)配車間相比，除了4 h，其余各時間段調(diào)配車間的菌群密度與粉碎車間的菌群密度相比都是顯著降低（P＜0.05），可能是因為調(diào)配車間機械化程度高，管道較多，無鼓風設(shè)備，生產(chǎn)人員較少，故空氣中微生物較少，潔凈度[18]一直處于較高水平，并且在2和6 h時與罐裝車間相比并無顯著性差異（P＞0.05）。整體上，各車間空氣菌群密度由低到高分別為：罐裝車間＜調(diào)配車間＜粉碎車間＜原料庫房。

粉碎車間、調(diào)配車間和罐裝車間的菌群密度在生產(chǎn)前期（0～2 h）顯著增加（P＜0.05），說明車間開始生產(chǎn)后可能由于人員活動和機器運轉(zhuǎn)導(dǎo)致原輔料和地面上微生物浮游在空氣中，導(dǎo)致空氣潔凈度降低。粉碎車間和調(diào)配車間的菌群密度在生產(chǎn)后期（8～10 h）顯著降低（P＜0.05），說明生產(chǎn)完成后空氣中的微生物逐漸減少，空氣等級提高。由表1、表2可知，罐裝車間空氣采樣菌群密度平均為5.51×102CFU/m3，且腸桿菌科菌監(jiān)測值為0，略低于徐廷弼等[19]在某辣椒醬廠包裝車間測得好氧菌的菌群密度8.2×102CFU/m3，可能是因為其包裝車間只采用了紫外殺菌和定期消毒的方式，而本研究中的罐裝車間在上述殺菌基礎(chǔ)上額外增加了臭氧殺菌的方式。

表1 富順香辣醬生產(chǎn)過程環(huán)境中菌群密度變化情況Table 1 Changes of bacterial density in the environment during the production of Fushun spicy sauce

表2 富順香辣醬生產(chǎn)過程中環(huán)境中腸桿菌科菌群密度變化情況Table 2 Changes in the density of Enterobacteriaceae in the environment during the production of Fushun spicy sauce

罐裝車間由于為生產(chǎn)最后環(huán)節(jié)，生產(chǎn)人員進入車間前需要經(jīng)過清潔間、風淋室等以達到盡量減少人員帶入菌的可能性，且罐裝車間為一個比較封閉獨立的空間，故罐裝車間空氣中腸桿菌科菌和菌總量均較少。

2.1.2 設(shè)備腸桿菌科菌測定結(jié)果 如表3所示，罐裝車間設(shè)備表面及設(shè)備與食品接觸面腸桿菌科菌均未檢出腸桿菌科菌，這可能是因為人員進入罐裝車間需經(jīng)過清潔間、風淋室，罐裝車間空間相對封閉獨立且人員管理良好，故罐裝車間空氣潔凈等級比較高，微生物含量少。

表3 富順香辣醬罐裝車間設(shè)備腸桿菌科菌測定結(jié)果Table 3 Detection results of Enterobacteriaceae in equipment of Fushun spicy sauce canned workshop

2.1.3 生產(chǎn)人員腸桿菌科菌測定結(jié)果 如表4所示，罐裝車間生產(chǎn)人員在清潔前，只有2#生產(chǎn)人員帶有腸桿菌科菌，但清潔后，檢測結(jié)果為0，說明清潔方法能有效殺菌。罐裝人員在完成清潔后人員手部均未攜帶腸桿菌科菌，工作5 h后有一人攜帶了腸桿菌科菌，其余2人均未攜帶腸桿菌科菌，這可能與個人操作有關(guān)，或者生產(chǎn)結(jié)束后與鼻腔等接觸有關(guān)。

表4 富順香辣醬罐裝車間生產(chǎn)人員腸桿菌科菌測定結(jié)果Table 4 Detection results of Enterobacteriaceae of production personnel in Fushun spicy sauce canned workshop

2.2 腸桿菌科鑒定結(jié)果

2.2.1 理化鑒定結(jié)果

2.2.1.1 生理生化鑒定結(jié)果 根據(jù)表5中生理生化鑒定結(jié)果，參考《伯杰細菌鑒定手冊》[20]，初步鑒定除菌株F2和D2外，其余菌株皆為腸桿菌科的細菌。

表5 車間和人員腸桿菌科疑似菌鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of suspected Enterobacteriaceae strains in workshop and personnel

2.2.1.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 部分腸桿菌科疑似菌16S rDNA序列PCR擴增電泳圖如圖1所示；可知8條亮帶均在1500 bp左右位置出現(xiàn)，并且無明顯非特異擴增現(xiàn)象，符合測序要求。

圖1 部分代表性腸桿菌科疑似菌16S rDNA序列PCR擴增序列電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified sequence of 16S rDNA of some representative Enterobacteriaceae suspected bacteria

將條帶清晰的PCR 擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對，確定各菌株的分類地位。結(jié)果如表6所示。

對香辣醬各生產(chǎn)車間、生產(chǎn)人員檢測出的菌種進行分離純化經(jīng)16S rDNA測序后與Genbank中數(shù)據(jù)做相似性分析的結(jié)果如表6所示，由表分析可知，分離出14株菌株，致病菌占13株。其中斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii）[20]、奧斯勒莫拉氏菌（Moraxella osloensis）[21]、香坊腸桿菌（Enterobacter xiangfangensis）[22]、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）[23]為腸桿菌科致病細菌；2株不動桿菌屬（Acinetobactersp.）[24]、2株鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）[25]、阿爾塔米拉金色單胞菌（Aureimonas altamirensis）[26]、棲麥假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）[27]、綠膿桿菌（Pseudomonas baetica）[28]、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）[29]均為致病細菌；紅綬曲霉（Aspergillus nomius）[30]為致病菌；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）[31]為非致病菌。

表6 車間和人員腸桿菌科疑似菌16S rDNA同源性對比Table 6 16S rDNA homology comparison of suspected Enterobacteriaceae bacteria in workshop and personnel

研究表明，徐廷弼等[19]在某辣椒醬各車間分離到葡萄球菌、克雷伯氏桿菌、陰溝腸桿菌，與本研究結(jié)果基本相符；在部分藥品企業(yè)車間檢出不動桿菌屬、普羅維登斯菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等[32]，說明調(diào)味品與藥品的生產(chǎn)車間細菌類群具有一定相似性。

2.3 溯源分析

將生產(chǎn)環(huán)境中鑒定出的菌種利用聚類分析軟件MEGA 6.0進行聚類分析，采用鄰位相連法（Neighbour-Joining）建立生產(chǎn)環(huán)境中菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2：

圖2 用鄰近法基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rDNA sequences

通過對整個系統(tǒng)發(fā)育樹觀察可知，調(diào)配車間分離出的菌與粉碎車間和罐裝車間分離出的菌都具有較高的同源性，可能是因為調(diào)配車間為生產(chǎn)工藝的中間環(huán)節(jié)，且粉碎車間和調(diào)配車間分布結(jié)構(gòu)為上下結(jié)構(gòu)且有人員流動。從上面的大分支看可知，Aureimonasaltamirensis是上面分支最原始的菌，且該菌分離于原料庫房，由此看出整個工藝流程的車間環(huán)境都與原料庫房有關(guān)；Krizova等[33]研究發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬廣泛存在于土壤和水系統(tǒng)中，而原料庫房與外界環(huán)境聯(lián)系最緊密，與在原料庫房中分離出不動桿菌屬的結(jié)果相符，生產(chǎn)人員手上分離出的3株菌與原料庫房的菌同屬于不動桿菌屬，而生產(chǎn)人員進入車間前經(jīng)過嚴格的消毒殺菌和驗證消毒，說明生產(chǎn)人員所攜帶的菌來源于原輔料；另外生產(chǎn)人員手上還分離出Klebsiella pneumoniae，該菌與粉碎車間的Moraxella osloensis在同一分支上，但自展值較低，意義不大；罐裝車間的Alcaligenes faecali與上述兩種菌的自展值也較低。綜上可知，腸桿菌科菌可能存在于原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、生產(chǎn)人員等環(huán)節(jié)。原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間空氣環(huán)境中存在交叉污染現(xiàn)象；罐裝車間和調(diào)配車間存在同源性較高的致病菌，推測可能因為人員流動和人員清潔不徹底或頻率不達標造成了交叉污染[34]。

3 結(jié)論與展望

通過對香辣醬生產(chǎn)環(huán)境（包括原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、罐裝車間、設(shè)備和生產(chǎn)人員）進行動態(tài)監(jiān)控和微生物的培養(yǎng)，分離出食源性致病菌，結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化鑒定和分子生物技術(shù)進行鑒定和溯源分析。從監(jiān)控結(jié)果來看，各車間整體清潔度由低到高分別為：原料庫房＜粉碎車間＜調(diào)配車間＜罐裝車間。各個車間加工過程中清潔度由生產(chǎn)前較低到生產(chǎn)過程中高再隨著生產(chǎn)結(jié)束逐漸降低。腸桿菌科疑似菌的菌群密度均遠小于菌落總數(shù)菌群密度，原料庫房空氣中最多，數(shù)量隨著生產(chǎn)開始逐漸增加，生產(chǎn)后2 h達到峰值，然后隨著生產(chǎn)結(jié)束而減少；罐裝車間空氣中和設(shè)備表面的腸桿菌科菌監(jiān)測值都為0。從鑒定結(jié)果看，各生產(chǎn)車間中均檢出致病菌，分離出14株菌種中致病菌13株。通過溯源分析可以看出，原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、罐裝車間空氣環(huán)境中存在交叉污染現(xiàn)象，并且各個車間和生產(chǎn)人員分離出的菌與原料庫房環(huán)境中的菌都具有較高同源性，由此可以推測出可能是原輔料中所帶的菌隨著生產(chǎn)工藝流程的推進，逐步污染了生產(chǎn)人員、粉碎車間、調(diào)配車間和罐裝車間；也可能是人員流動和人員清潔不到位或頻率不達標造成了交叉污染。

本研究豐富了香辣醬生產(chǎn)環(huán)境中食源性致病細菌數(shù)據(jù)庫，為完善溯源系統(tǒng)和HACCP體系提供了理論基礎(chǔ)。為健全體系，還需探明原輔料中的食源性致病細菌、原料庫房的最優(yōu)儲存條件、最優(yōu)防腐工藝和殺菌工藝，來提高香辣醬的食用安全性，為傳統(tǒng)的香辣醬生產(chǎn)提供保障，實現(xiàn)食源性致病細菌風險的可防可控。