瑞士乳桿菌H11發(fā)酵乳飲料的ACE抑制活性及代謝組學(xué)研究

王昊乾，李伯海，趙景娜，劉文俊，陳永福，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

活性乳飲料是指將原料乳經(jīng)過(guò)益生菌發(fā)酵后得到的具有獨(dú)特風(fēng)味特點(diǎn)和有利于人體健康的乳制品[1]。能夠用于活性乳飲料中的微生物需具有良好的益生功效，且能夠耐受胃腸液并定殖于人體腸道保持活性，進(jìn)而促進(jìn)人體健康[2-3]。瑞士乳桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性異型發(fā)酵乳酸菌，具有較強(qiáng)的蛋白水解系統(tǒng)，能夠通過(guò)水解牛乳中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸和多肽[4]，這些代謝物有助于發(fā)酵乳制品質(zhì)地和風(fēng)味的形成[5]。在發(fā)酵過(guò)程中，瑞士乳桿菌通過(guò)蛋白酶水解產(chǎn)生大量的生物活性肽，賦予了發(fā)酵乳制品優(yōu)良的益生特性[6-7]。研究表明，具有生物活性功能的發(fā)酵乳制品具有提高免疫力、加強(qiáng)老年人認(rèn)知功能、抗突變、降血壓和抗氧化等健康功效[8-9]。

高血壓是威脅人體健康的慢性疾病之一，人體自身可通過(guò)多種途徑來(lái)調(diào)節(jié)血壓，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）對(duì)維持血壓平衡起關(guān)鍵作用[10]，但藥物治療高血壓會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)，而酶促水解和微生物發(fā)酵牛奶蛋白所釋放出的降血壓肽不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用[11]。過(guò)去的十幾年中，食品衍生肽為預(yù)防和治療高血壓方面提供了理論依據(jù)[12-13]。

目前市面上常見(jiàn)的發(fā)酵乳飲料，如日本的養(yǎng)樂(lè)多、伊利每益添和蒙牛優(yōu)益C等發(fā)酵乳飲料基本選擇干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑，例如蒙牛優(yōu)益C選擇使用副干酪乳桿菌Lc-01作為發(fā)酵劑[1,14]，而使用瑞士乳桿菌在功能性飲料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面的研究較少[14]。因此，本文以商業(yè)發(fā)酵劑副干酪乳桿菌Lc-01作為對(duì)照組，以前期篩選的一株具有良好發(fā)酵及益生特性的瑞士乳桿菌H11為研究對(duì)象，旨在研究瑞士乳桿菌H11在活性乳飲料貯藏期間的ACE抑制活性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和代謝物與副干酪乳桿菌Lc-01之間的差異，為開(kāi)發(fā)新型安全高效的益生菌乳飲料提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌H11 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫(kù)提供，副干酪乳桿菌Lc-01 購(gòu)自丹麥科漢森公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE，0.25 U/g）、馬尿酸（HA）、馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL） Sigma公司；三氟乙酸分析級(jí)、乙腈色譜級(jí)、甲醇色譜級(jí) Fisher Chemicals公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然公司。

7697A-GC-7890B-MS-5977C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent1100液相色譜系統(tǒng) Agilent公司；UPLC-Q TOF-MS超高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳飲料的制備 將13%的脫脂奶粉和2%的葡萄糖溶解于45 ℃蒸餾水中，攪拌均勻，靜置30 min[15]。在115 ℃下加熱10 min后取出，分裝至250 mL無(wú)菌瓶中，待其褐變后冷卻至37 ℃，分別接種5×106CFU/mL瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01，在37 ℃下發(fā)酵。當(dāng)?shù)味ㄋ岫龋═iter acidity，TA）達(dá)到200oT時(shí)停止發(fā)酵。最后將發(fā)酵乳與無(wú)菌蔗糖溶液按體積比25:75進(jìn)行混合，冷藏28 d，在貯藏0、7、14、21、28 d時(shí)分別取樣，用于分析測(cè)定。

1.2.2 體外ACE抑制活性的測(cè)定 樣品前處理：將樣品于4500×g，離心10 min，取上清液，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.3。取發(fā)酵乳飲料上清液和HHL溶液各100 μL混合，于37 ℃下培養(yǎng)2 min，再加入100 μL的ACE，將混合物在37 ℃下孵育40 min。在85 ℃水浴中加熱10 min；將反應(yīng)液注入400 μL的0.1 mol/L EDTA溶液中，使用0.22 μm的濾膜過(guò)濾待測(cè)。

使用RP-HPLC法測(cè)定酶解反應(yīng)產(chǎn)物中馬尿酸的含量。色譜柱為ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent，USA），流動(dòng)相：體積比為22%乙腈（含0.1%三氟乙酸）和78%去離子水（含0.1%三氟乙酸）溶液；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

式中，[HA]c：空白對(duì)照組中馬尿酸濃度；[HA]s：含有ACE抑制劑的待測(cè)樣品中馬尿酸濃度；[HA]h：HHL標(biāo)品中馬尿酸濃度。

1.2.3 ACE抑制肽（Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP））含量測(cè)定 樣品前處理：將樣品于4500×g，離心10 min，取100 μL樣品與400 μL的乙腈混合，于12000×g離心10 min，樣品于0.22 μm濾膜過(guò)濾后，上機(jī)檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為4 μL；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的去離子水；流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫程序（B%）：

0～1 min，3%B；1～5 min，3%～30%B；5～5.1 min，30%～90%B；5.1～7.1 min，90%B；7.1～7.2 min，90%～3%B；7.2～9.2 min，3%B。

1.2.4 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 萃取頭老化條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，老化20 min。

固相微萃取條件：將老化好的萃取頭插入樣品瓶中，50 ℃，300 r/min下吸附60 min，隨后在進(jìn)樣口處250 ℃解吸附3 min。

氣相色譜條件：升溫程序：起始溫度為35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升溫至140 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為氦氣（≥99.999%），流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI源，電子能量70 eV；發(fā)射電流100 μA；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍（m/z）33～450。利用GC/MS工作站軟件Masshunter自帶NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律確定化學(xué)成分，利用面積歸一化法計(jì)算出各組分相對(duì)峰面積百分比。

1.2.5 代謝差異物分析 色譜條件：使用BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm），柱溫40 ℃、流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。最佳流動(dòng)相由（A）0.1%甲酸水溶液和（B）0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～6 min，5%～40%B；6～18 min，40%～85%B；18～18.5 min，85%～90%B；18.5～22 min，90%～90%B；22～22.5 min，90%～5%B；22.5～25 min，5%B。

質(zhì)譜條件：采用ESI正離子（ESI+）模式進(jìn)行掃描，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶氣流量為800 L/h，錐氣流量為50 L/h，毛細(xì)管電壓為3 kV，采樣錐電壓為40 V，碰撞能量為6 eV，萃取錐電壓為3 V，荷質(zhì)比掃描范圍50～1200 m/z。采用濃度為為200 ng/mL的亮氨酸-腦啡肽（556.2771 u）作為校正液，流速為30 μL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性和方差分析；用Origin 8.5用于繪制圖表；將UPLC/Q-TOF MS測(cè)定的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MassLynx 4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)SIMCA 14.0和MetaboAnalyst v.5.0進(jìn)行主成分分析、T檢驗(yàn)分析和選擇差異變量（P＜0.05），與METLIIN、HMDB、KEGG、MASSBANK等生化數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比較，對(duì)代謝差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ACE抑制率的變化分析

已有研究表明，乳桿菌屬的發(fā)酵乳中具有較高的ACE抑制活性，瑞士乳桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解系統(tǒng)，通過(guò)水解牛乳蛋白能夠產(chǎn)生具有ACE抑制活性的肽，進(jìn)一步水解產(chǎn)生氨基酸，滿足了發(fā)酵乳制品的營(yíng)養(yǎng)需求[16]。從圖1可以看出，瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01的發(fā)酵乳飲料在貯藏期間均顯示出對(duì)ACE的抑制活性，這是由于益生菌的胞外蛋白酶將牛奶蛋白水解為寡肽，然后被胞內(nèi)肽酶進(jìn)一步水解為小肽和氨基酸[17]。而存在于肽的C端末位的疏水性氨基酸（例如Try、Phe、Trp、Ala、Ile、Val和Met）或帶正電荷的氨基酸（例如Arg和Lys以及Pro）均具有較高的ACE抑制活性[18]，例如，在C末端存在苯丙氨酸殘基可能會(huì)增加肽的ACE抑制活性[10]。瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發(fā)酵乳飲料中的ACE抑制活性在貯藏過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，且瑞士乳桿菌H11比副干酪乳桿菌Lc-01顯示出更高的ACE抑制活性，尤其是在貯藏21 d時(shí)瑞士乳桿菌H11表現(xiàn)出最高的ACE抑制活性（70.13%±2.83%），這可能是貯藏過(guò)程中pH和鈣離子濃度的變化導(dǎo)致了蛋白質(zhì)二次水解[17,19]。

圖1 貯藏期間發(fā)酵乳飲料的ACE抑制率變化Fig.1 Change in ACE inhibition of fermented milk beverages during storage

2.2 VPP和IPP含量測(cè)定

瑞士乳桿菌通過(guò)水解牛乳中的蛋白質(zhì)釋放大量的肽，例如抗高血壓肽VPP和IPP以及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，其中ACE是控制高血壓疾病的有效治療靶點(diǎn)。從圖2可知，在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11的發(fā)酵乳飲料中的VPP和IPP含量顯著高于Lc-01（P＜0.05），且Lc-01的乳飲料在貯藏期間未檢測(cè)到IPP且只檢測(cè)到少量的VPP，這也是瑞士乳桿菌H11發(fā)酵乳飲料中ACE抑制活性高于Lc-01的原因。Chen等[6]證明了瑞士乳桿菌H9制備的發(fā)酵乳中具有86.4%±1.5%的體外ACE抑制活性，并且具有較高的VPP（2.409±0.229 μmol/L）和IPP（1.612±0.114 μmol/L）濃度。研究發(fā)現(xiàn)除了VPP和IPP外，通過(guò)水解蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的生物活性肽，例如αs1-CNf（90～94）（RYLGY）、αs1-CNf（143～149）（AYFYPEL）和αs2-CNf（89～95）（YQKFPQY）等多種活性肽也具有降血壓的功能[20-21]。

圖2 貯藏期間發(fā)酵乳飲料中VPP和IPP含量的變化Fig.2 Changes in VPP and IPP content of fermented milk beverages during storage

2.3 基于SPME-GC-MS技術(shù)的風(fēng)味物質(zhì)分析

發(fā)酵乳飲料中具有多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其決定了發(fā)酵乳飲料的獨(dú)特風(fēng)味，采用SPME-GCMS技術(shù)對(duì)2組發(fā)酵乳飲料進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，瑞士乳桿菌H11的發(fā)酵乳酸菌飲料中共檢測(cè)54種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酮類物質(zhì)6種，醇類物質(zhì)13種，醛類物質(zhì)7種，酸類物質(zhì)10種，酯類物質(zhì)8種，其他物質(zhì)10種，對(duì)照樣品中共檢測(cè)73種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酮類物質(zhì)13種，醇類物質(zhì)16種，醛類物質(zhì)6種，酸類物質(zhì)12種，酯類物質(zhì)6種，其他物質(zhì)20種。為了研究2組樣品之間的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異以及貯藏時(shí)間對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，選擇在貯藏過(guò)程中均含有且相對(duì)含量較高的7種風(fēng)味物質(zhì)，包括2-庚酮、2-壬醇、2-壬酮、2-十一烷酮、乙酸、2-十一烷醇和十一醛，各物質(zhì)相對(duì)含量見(jiàn)表1。

由表1可以看出，瑞士乳桿菌H11和對(duì)照菌株Lc-01樣品中的2-庚酮、2-壬酮相對(duì)含量均較高，在4 ℃貯藏28 d后分別為43.84%、12.39%和26.29%、15.80%。酮類物質(zhì)產(chǎn)生是由于氨基酸的熱降解、游離脂肪酸氧化和美拉德反應(yīng)形成的，研究表明2-庚酮能夠賦予發(fā)酵乳水果味[22]，2-壬酮能賦予發(fā)酵乳果香、清香及奶油氣息[23]。瑞士乳桿菌H11發(fā)酵乳飲料中的醇類和醛類物質(zhì)含量在貯藏期間顯著低于副干酪乳桿菌Lc-01（P＜0.05），醛源自乳脂中不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化，因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)活躍的化學(xué)特性，很容易被還原成酸性化合物或醇類[24]。酸是甲基酮、醇、內(nèi)酯和酯類物質(zhì)的前體，對(duì)乳制品中的氣味產(chǎn)生非常重要[25]，在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11發(fā)酵乳飲料中的己酸含量較高，其為乳制品提供類似于醋的強(qiáng)烈風(fēng)味[26]。劉曉嬌等[27]采用GC-MS技術(shù)對(duì)活性乳酸菌飲料的香氣產(chǎn)物分析表明，主要的風(fēng)味物質(zhì)包括丁酸乙酯、己醛、2-庚酮、3-丁烯-1-醇、乙酸、2-壬酮等，其中2-庚酮和2-壬酮相對(duì)含量最高，分別為37.68%和17.86%，乙酸含量為4.97%，與本試驗(yàn)結(jié)果相近。上述結(jié)果可得知，L.helveticusH11能夠賦予發(fā)酵乳飲料香氣，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

表1 貯藏期間發(fā)酵乳飲料中的風(fēng)味物質(zhì)的變化Table 1 Changes in flavour substances of fermented milk beverages during storage

2.4 基于代謝組學(xué)的代謝物差異分析

使用代謝組學(xué)分析貯藏過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化，從而預(yù)測(cè)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[28]。通過(guò)UPLC/QTOF MS/MS監(jiān)測(cè)了瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01兩種發(fā)酵乳飲料在不同時(shí)間點(diǎn)的代謝譜變化，尋找兩種發(fā)酵乳飲料之間的差異代謝物，在瑞士乳桿菌H11和Lc-01中分別檢測(cè)到333和309種代謝物。為了可視化兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的代謝動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行了PCA分析（圖3）。兩種發(fā)酵乳飲料分別形成兩個(gè)區(qū)域，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，代謝譜發(fā)生了變化，于14 d后保持穩(wěn)定。這表明在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01仍具有代謝活性，使發(fā)酵乳飲料中的蛋白質(zhì)發(fā)生二次水解，產(chǎn)生了更多的生物活性物質(zhì)。

圖3 貯藏期間兩種發(fā)酵乳飲料代謝差異物的變化Fig.3 Changes in metabolic differentials of two fermented milk beverages during storage

瑞士乳桿菌通過(guò)細(xì)胞膜蛋白（CEP）將牛奶中的蛋白質(zhì)分解為寡肽，再通過(guò)細(xì)胞內(nèi)肽酶進(jìn)一步水解成游離氨基酸，形成揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物，從而賦予發(fā)酵乳飲料特殊的風(fēng)味[29]。當(dāng)VIP值＞1.5，F(xiàn)old Change（差異倍數(shù)）＞2和P＜0.01時(shí)，在瑞士乳桿菌H11和對(duì)照發(fā)酵乳飲料中鑒定出16種代謝差異物，包括12種下調(diào)的代謝產(chǎn)物和4種上調(diào)的代謝產(chǎn)物（表2），主要為氨基酸、肽和有機(jī)酸；研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)LC-MS和GC-MS兩種代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)發(fā)酵乳制品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要的代謝產(chǎn)物以氨基酸、短肽、脂類和有機(jī)酸為主[29]。通過(guò)對(duì)比KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01之間的代謝差異物主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)以及磷酸戊糖途徑，由于牛乳中的必需氨基酸成分較少，瑞士乳桿菌缺乏16種氨基酸合成基因，是高度營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，通過(guò)自身復(fù)雜的蛋白酶水解系統(tǒng)水解牛乳蛋白產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸來(lái)維持生長(zhǎng)發(fā)育，這可能是瑞士乳桿菌H11發(fā)酵乳飲料中四種游離氨基酸（4-氨基丁醛、L-脯氨酸、L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸）濃度在發(fā)酵和儲(chǔ)存期間高于副干酪乳桿菌Lc-01的原因[21,30]；另外，有研究發(fā)現(xiàn)由于瑞士乳桿菌自身復(fù)雜的水解系統(tǒng)，在發(fā)酵過(guò)程中能夠有助于改善發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)地，同時(shí)產(chǎn)生的生物活性肽有益于人體健康[31-32]。

表2 瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發(fā)酵乳飲料在貯藏期間共有代謝產(chǎn)物變化Table 2 Changes in shared metabolites of L. helveticus H11 and L. paracasei Lc-01 fermented milk beverages during storage

3 結(jié)論

本文通過(guò)液相色譜、SPME-GC-MS和UPLCQ-TOF MS等代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發(fā)酵乳飲料的ACE抑制活性、代謝差異物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，瑞士乳桿菌H11的ACE抑制活性比副干酪乳桿菌Lc-01高60%以上，ACE抑制肽VPP和IPP含量也顯著高于Lc-01（P＜0.05）。瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01的主要代謝差異物為氨基酸、肽和有機(jī)酸，瑞士乳桿菌H11制備的活性乳飲料酸味更強(qiáng)且有奶油香氣。綜上所述，瑞士乳桿菌H11在降血壓功能性發(fā)酵乳飲料的開(kāi)發(fā)具有廣闊的發(fā)展前景。