AMPK活化調(diào)控的能量代謝對(duì)宰后牦牛肉肉色穩(wěn)定性影響的研究

陳煉紅，王琳琳，高代微

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

肉色是影響鮮肉適銷(xiāo)性的重要因素之一，而鮮亮的櫻桃紅色通常是消費(fèi)者作為評(píng)價(jià)鮮肉新鮮和健康的標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，諸多學(xué)者對(duì)影響肉色及肉色穩(wěn)定性的因素進(jìn)行了廣泛的研究，其中部分學(xué)者研究了線粒體在肉色及肉色穩(wěn)定性中的作用。如Arihara等[1]研究發(fā)現(xiàn)高鐵肌紅蛋白還原酶（Metmyoglobin reductase activity，MetMbR）活性作為影響鮮肉在貯藏期間肉色穩(wěn)定性的一個(gè)重要的因子，其主要存在于線粒體上，微粒體上很少；Joseph等[2]研究發(fā)現(xiàn)添加丙酮酸、乳酸鹽、琥珀酸鹽和蘋(píng)果酸等三羧酸循環(huán)中間的代謝產(chǎn)物于宰后肌肉中，能夠刺激肌肉再生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的過(guò)程，進(jìn)而提高高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MMb）的還原能力，維持肉色的穩(wěn)定。

不同部位牦牛肉在宰后成熟過(guò)程中肉色穩(wěn)定性具有的差異性。同時(shí)，本課題組在前期研究中已明確和其他部位相比，牦牛背最長(zhǎng)肌肉色具有較好的穩(wěn)定性。因此，本研究以牦牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，分別以AICAR和Compound C為激活劑和抑制劑，測(cè)定宰后成熟過(guò)程中肉色及能量代謝的相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)，確定能量代謝指標(biāo)與肉色指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期明確AMPK活化調(diào)控的能量代謝對(duì)宰后牦牛肉肉色穩(wěn)定性的影響以及為闡明宰后牦牛肉肉色穩(wěn)定性機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛背最長(zhǎng)肌 選取產(chǎn)自四川省紅原縣同一牧場(chǎng)，平均年齡3.5歲、生長(zhǎng)發(fā)育良好、體重相近的牦牛4頭，以宰后將牦牛背最長(zhǎng)肌置于液氮中保存；AICAR、Compound C、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯乙酸、濃硫酸、硫脲、蒽酮、葡萄糖、蔗糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硫酸銅、牛血清蛋白等 均為分析純，成都康迪生物技術(shù)有限公司；牛MR ELISA試劑盒、牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）ELISA試劑盒、牛NADH ELISA試劑盒、牛GS試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；乳酸試劑盒、肌酸激酶試劑盒、己糖激酶試劑盒、LDH試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FSH-2A可調(diào)高速組織勻漿機(jī) 金壇市華城海龍實(shí)驗(yàn)儀器廠；Thermo Scientific Revco ULT-1786-6V超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛科技公司；MP511 Lab pH計(jì) 上海三信儀表廠；UV2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Rayto RT-6100酶標(biāo)儀 濟(jì)南駿馳生物科技有限公司；pH STAR胴體肌肉pH值直測(cè)儀 德國(guó)Ingenieurhuro R.Matthaus公司；CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minolta 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本處理 將液氮中保存的肉樣恢復(fù)至0 ℃左右，迅速剔除表面的脂肪和結(jié)締組織，并將其迅速切成5×5×4 cm的肉塊，隨機(jī)分成三組，按照肉液比10：1（w/v）將溶液均勻的注射進(jìn)肉樣。第一組注射50 mmol/L AICAR溶液，第二組注射50 mmol/L Compound C溶液，第三組作為空白對(duì)照樣品，并將樣品放置于4 ℃條件下成熟，時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)置為6、12、24、72、120、168 h，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定pH、肉色、MetMbR、AMPK活性、NADH含量、糖原合成酶（GS）活性和乳酸脫氫酶（LDH）活性等指標(biāo)的測(cè)定[4]。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 AMPK活性測(cè)定 AMPK活性的測(cè)定參照董笑含[9]的方法。AMPK通過(guò)AMPKα亞基上的Thr172位點(diǎn)磷酸化被激活，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）的水平來(lái)確定AMPK的活性，具體操作和結(jié)果計(jì)算參照牛p-AMPK酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2.2 肉色測(cè)定 在相應(yīng)的成熟時(shí)間點(diǎn)取樣，采用已經(jīng)進(jìn)行白板校正的色差儀測(cè)定肉色，每個(gè)肉樣取5個(gè)不同的點(diǎn)測(cè)定其L*值、a*值和b*值，取其平均值。并計(jì)算H*，公式為：

在國(guó)外，融資租賃之所以發(fā)展快速，一方面是因?yàn)槠鸩捷^早，另一方面是因?yàn)檎畬?duì)該行業(yè)的扶持。而我國(guó)，政府近幾年才對(duì)該行業(yè)重視，但人才的培養(yǎng)、市場(chǎng)環(huán)境的完善都需要時(shí)間，該行業(yè)缺乏一個(gè)整體、系統(tǒng)的政策支持。尤其是西部地區(qū)，西部市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)沒(méi)有東部發(fā)達(dá)，對(duì)外資的吸引力不強(qiáng)，這方面更加需要政府的幫助。目前，西部融資租賃業(yè)面臨兩大發(fā)展機(jī)遇：其一，正值“西部大開(kāi)發(fā)”計(jì)劃的第二階段，是加快西部經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)化以及市場(chǎng)化步伐的關(guān)鍵時(shí)期。其二，習(xí)總書(shū)記2013年提出的“一帶一路”囊括了我國(guó)西部絕大部分地區(qū)，這對(duì)西部的發(fā)展又是一個(gè)強(qiáng)有力的推動(dòng)。西部各級(jí)政府應(yīng)借此機(jī)遇，助力融資租賃業(yè)的發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)[6]。

1.2.2.3 pH測(cè)定 使用胴體pH計(jì)測(cè)定。取各樣品3個(gè)不同位置點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算并取其平均值。

1.2.2.4 總色素含量測(cè)定 參照Krzywicki等[10]的方法，略做修改。取肉樣10 g，加入0.04 mol/L、pH6.8的磷酸鹽緩沖液20 mL，勻漿25 s。勻漿液在4 ℃條件下靜置1 h后，在3300 r/min條件下離心30 min。用濾紙過(guò)濾所取上清液并用上述緩沖液定容至25 mL，測(cè)定波長(zhǎng)分別為525、545、565、572 nm處樣品的吸光度。

式中：R1、R2、R3分別是吸光率比值A(chǔ)572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.2.2.5 糖原含量測(cè)定 糖原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采用蒽酮比色法測(cè)定糖原含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取6支20 mL試管作為標(biāo)準(zhǔn)管，編號(hào)后分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL），再依次加入蒸餾水3、2.5、2、1.5、1、0.5 mL，再分別沿試管壁緩緩加入4 mL蒽酮試劑（0.2 g蒽酮和2.0 g硫脲溶解于100 mL濃硫酸），混合后震蕩1 min，立即置冰水中冷卻。將冷卻好的試管放入沸水浴中煮沸15 min，取出試管立即放入冷水中充分冷卻，將冷卻好的液體倒入玻璃比色皿中，于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。制得的糖原標(biāo)曲為y=2.2989x-0.0029，R2=0.9996。其中y為吸光值，x為糖原濃度（mg/mL）。

糖原含量測(cè)定：參照王琳琳[11]的方法并加以修改測(cè)定。準(zhǔn)確稱取肉樣1 g，加入5%的三氯乙酸8 mL，研磨至固體消失。將研磨液在8000 r/min，4 ℃下離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中，震蕩混勻；取2.5 mL上述溶液，加入4 mL蒽酮試劑，混合后震蕩1 min，立即置冰水中冷卻，冷卻后再沸水浴15 min，充分冷卻后，于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，之后操作步驟同上。用以下公式計(jì)算糖原含量：

式中：Y：糖原含量，mg/g；M：通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線查得1 mL提取液中的葡萄糖當(dāng)量，mg/mL；0.9：將葡萄糖換算為糖原的系數(shù)；25：定容體積，mL。

1.2.2.6 NADH含量、MetMbR和GS活性測(cè)定NADH含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活性和糖原合成酶活性測(cè)定均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒進(jìn)行，具體操作和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2.7 乳酸含量、LDH活性、己糖激酶活性和肌酸激酶活性測(cè)定 乳酸含量、乳酸脫氫酶活性、己糖激酶活性和肌酸激酶活性的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行，具體操作和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)測(cè)定的平均值，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性方差分析，顯著性水平P＜0.05。作圖采用Microsoft 2016 Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后成熟期間AMPK活性的變化

由圖1可知：在宰后肌肉成熟過(guò)程中，三組AMPK的活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，這個(gè)結(jié)果與高永芳等[12]研究結(jié)果相似。在成熟初期（6～12 h）AMPK活力顯著上升（P＜0.05），這是由于動(dòng)物宰后氧氣中斷，肌肉進(jìn)行糖酵解產(chǎn)生能量，ATP含量減少，而肌肉中ATP的消耗仍在繼續(xù)，使得AMP：ATP的比值增加，從而激活A(yù)MPK[4]。成熟12 h后AMPK活力顯著下降（P＜0.05），這可能是由于胴體糖原含量有限，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)糖原逐漸被消耗完，糖酵解逐漸停止，AMPK活性不再升高，因此宰后AMPK被激活后不久，活性即開(kāi)始下降[5]。

圖1 成熟期間牦牛肉AMPK活力的變化Fig.1 Changes of AMPK activity of yak beef during postmortem aging

此外，在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，AICAR組的AMPK活力顯著高于其余兩組（P＜0.05），而對(duì)照組的AMPK活力顯著高于抑制組（P＜0.05）。說(shuō)明AICAR對(duì)AMPK的活性起到了激活作用，成熟至12 h，AICAR組、對(duì)照組和Compound C組的AMPK活力均達(dá)到峰值，分別為76.07、67.22、61.15 U/L，與對(duì)照組相比，AICAR組AMPK活力提高了13.17%，而抑制組降低了9.03%。成熟至168 h，三者AMPK活力分別為42.01、39.95、37.03 U/L，與對(duì)照組相比，AICAR組AMPK活力提高了5.16%，而Compound C組降低了7.31%。表明隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，AICAR激活A(yù)MPK的能力逐漸下降，Compound C抑制AMPK的能力也逐漸下降[12]。該結(jié)果與高永芳等[12]研究結(jié)果一致。

2.2 AMPK活力對(duì)宰后成熟期間牦牛肉肉色的影響

由表1可知：在成熟過(guò)程中，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的L*值和a*值均呈先上升后下降趨勢(shì)，且L*值在120 h達(dá)到峰值，a*值在12 h達(dá)到最大值，與高永芳等[12]指出的AICAR處理的牛肉和對(duì)照組在宰后成熟期間L*值和a*值的變化趨勢(shì)基本一致。此外，在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，三者L*值的大小依次為AICAR組＞對(duì)照組＞Compound C組，其中除12 h外，在其余時(shí)間點(diǎn)AICAR組的L*均顯著高于Compound C組（P＜0.05）；而在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，a*值的大小依次為AICAR組＜對(duì)照組＜Compound C組，其中除12、120、168 h以外，其余時(shí)間點(diǎn)Compound C組與對(duì)照組的a*值均顯著高于AICAR組（P＜0.05）。成熟后期L*值上升是由于pH到達(dá)等電點(diǎn)，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等蛋白質(zhì)發(fā)生收縮和凝固而成為顆粒狀，使得游離水增加導(dǎo)致肉的系水力下降，滲出至肉表面的水分增多，肉色發(fā)亮[13]；a*值下降是因?yàn)榧∪庵蠴Mb與氧氣接觸，生成MMb（暗褐色），OMb（鮮紅色）含量的降低以及MMb含量的增加導(dǎo)致a*值的下降[8,12]。由以上分析可知，在整個(gè)成熟階段AICAR組的亮度更大，而Compound C組的肉色更紅。

表1 成熟期間牦牛肉肉色的變化Table 1 Changes in meat color of yak beef during postmortem aging

隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的b*值和H*值均呈逐漸上升的趨勢(shì)，其中b*值和H*值始終為AICAR組＞對(duì)照組＞Compound C組。并且除6、24 h以外，Compound C組的b*值均顯著低于其余時(shí)間點(diǎn)AICAR組的b*值（P＜0.05）；而在整個(gè)成熟階段，Compound C組的H*值均顯著低于AICAR組（P＜0.05）。由于H*值越低表示肉色越鮮紅，由此可知Compound C組的肉色較其余兩組鮮紅。

2.3 AMPK活力對(duì)宰后成熟期間牦牛肉pH的影響

由圖2可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組與對(duì)照組的pH均呈先下降后緩慢上升的趨勢(shì)，在成熟6～72 h時(shí)間段內(nèi)pH顯著下降（P＜0.05）。這是由于動(dòng)物宰后生化反應(yīng)還在繼續(xù)，肌糖原酵解產(chǎn)生乳酸和蛋白質(zhì)降解使得pH不斷下降[14]。同時(shí)，磷酸肌酸系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物肌酸以及ATP分解產(chǎn)生的磷酸也會(huì)使pH下降[15]。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)中釋放出來(lái)并且激活鈣激活酶，作用于肌間蛋白質(zhì)使其分解一些堿性物質(zhì)造成成熟后期肌肉的pH升高[16]。在整個(gè)成熟過(guò)程中，三者的pH大小始終為AICAR組＜對(duì)照組＜Compound C組。并且在成熟至120 h時(shí)，AICAR組、Compound C組以及對(duì)照組的pH分別下降至最低值5.53、5.61和5.67。與對(duì)照組相比，AICAR組pH降低了0.08，Compound C組pH上升了0.06，說(shuō)明AICAR組的pH下降速度較對(duì)照組快，Compound C組則與之相反。由此可知，AICAR加快了糖酵解進(jìn)程，縮短了宰后牦牛肉成熟時(shí)間，Compound C則與之相反。這與袁倩等[17]報(bào)道的AMPK活性與不同極限pH牛肉的產(chǎn)生密切相關(guān)的結(jié)論相一致。

圖2 成熟期間牦牛肉pH的變化Fig.2 Changes of pH of yak beef during postmortem aging

2.4 AMPK活力對(duì)宰后成熟期間牦牛肉色素含量的影響（TMb、OMb、MMb）

牦牛背最長(zhǎng)肌在宰后成熟期間AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的TMb含量變化結(jié)果如圖3所示。在成熟期間三組TMb含量均成下降趨勢(shì)，且6 h顯著高于168 h（P＜0.05）。這是由于隨著排酸時(shí)間的延長(zhǎng)，肌紅蛋白周?chē)?，使其與氧氣充分接觸，氧化生成MMb[18]。與自身的L*值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升的后下降的趨勢(shì)一致。AICAR組、Compound C組以及對(duì)照組成熟至168 h時(shí)，其TMb含量與6 h相比，分別下降了34.52%、31.63%和33.67%。說(shuō)明Compound C組TMb含量下降的速度較對(duì)照組和AICAR組慢，Compound C組在成熟過(guò)程中牦牛肉色穩(wěn)定性更佳。在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，除72 h以外，三者之間差異均不顯著（P＞0.05）。但從趨勢(shì)上可以看出，三者TMb含量高低依次為Compound C組＞對(duì)照組＞AICAR組。由于肌肉中肌紅蛋白的含量與分布影響牦牛的色澤，因此可以推測(cè)在成熟過(guò)程中Compound C組的肉色較對(duì)照組和AICAR組更鮮紅。

圖3 成熟期間牦牛肉TMb含量的變化Fig.3 Changes of TMb content of yak meat during postmortem aging

圖4 和圖5描述了AICAR組、Compound C組和對(duì)照組在成熟期間肌紅蛋白主要的兩種氧化狀態(tài)（OMb和MMb）相對(duì)含量的變化趨勢(shì)。在成熟初期（6 h）牦牛肉中肌紅蛋白主要以O(shè)Mb的形式存在，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的OMb分別為55.67%、60.17%和59.13%，MMb含量分別為9.84%、10.06%和12.35%，三者之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，三組OMb含量均呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），而MMb含量呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），OMb與MMb含量為“此消彼長(zhǎng)”模式。該結(jié)果與陳騁[19]等研究結(jié)果相一致。這是由于該實(shí)驗(yàn)在未隔絕氧氣的條件下成熟，因此DeoMb會(huì)快速與氧氣結(jié)合，形成OMb或直接氧化為MMb，而MMb不能及時(shí)還原為OMb，造成MMb的積累，從而使得肉色逐漸向MMb的暗褐色發(fā)展[19]。與成熟6 h相比，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的OMb含量在第168 h時(shí)分別降低了41.38%、40.40%和40.57%，而MMb含量則分別上升了310%、291%和309%。在整個(gè)成熟過(guò)程中，Compound C組的OMb含量始終高于其余兩組，且在24、72 h時(shí)差異顯著（P＜0.05）；而Compound C組的MMb含量始終低于其余兩組，12、24、72、168 h時(shí)差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明在整個(gè)成熟過(guò)程中Compound C組肌紅蛋白的氧化速率低于對(duì)照組和AICAR組，故Compound C組的肉色較對(duì)照組和AICAR組更鮮紅，與2.2結(jié)果相一致。

圖4 成熟期間牦牛肉OMb含量的變化Fig.4 Changes of OMb content of yak meat during postmortem aging

圖5 成熟期間牦牛肉MMb含量的變化Fig.5 Changes of MMb content of yak meat during postmortem aging

2.5 AMPK活力對(duì)宰后成熟期間MetMbR活性的影響

圖6 描述了牦牛背最長(zhǎng)肌在成熟期間AMPK活力的變化對(duì)其MetMbR活性的影響。如圖所示，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的MetMbR活性隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。成熟6 h時(shí)MetMbR活性顯著高于168 h時(shí)（P＜0.05），表明此時(shí)肌肉中MetMbR能夠及時(shí)的將氧化的肌紅蛋白還原，進(jìn)而降低了MMb的積累速率。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，成熟168 h時(shí)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的MetMbR活性僅為6 h的39.74%、42.72%和41.41%。MetMbR活性在成熟期間的變化規(guī)律解釋了圖5中相應(yīng)時(shí)期MMb含量迅速升高的原因。而在同一成熟時(shí)間內(nèi)，三者M(jìn)etMbR活性大小依次為Compound C組＞對(duì)照組＞AICAR組。說(shuō)明在整個(gè)成熟過(guò)程中，Compound C組高鐵肌紅蛋白還原能力優(yōu)于其余兩組。Mckenna等[20]對(duì)牛肉宰后胴體的色澤穩(wěn)定性的研究中指出，健康畜禽在屠宰后，其胴體中的MetMbR活性越高，相應(yīng)的肉色穩(wěn)定性就越高。由此可知，三者肉色穩(wěn)定性依次為Compound C組＞對(duì)照組＞AICAR組，即AMPK活力的抑制有利于牦牛背最長(zhǎng)肌在成熟期間肉色的穩(wěn)定。

圖6 成熟期間牦牛肉MetMbR活性的變化Fig.6 Changes of MetMbR activity of yak beef during postmortem aging

2.6 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉糖原的影響

由圖7可知，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的糖原含量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。糖原是機(jī)體能量的主要來(lái)源，在動(dòng)物屠宰以后，糖原進(jìn)行無(wú)氧酵解提供各種生化過(guò)程所需的能量，糖原含量會(huì)逐漸減少，生成乳酸使得pH下降，直至抑制糖酵解酶的活性為止[21]。在成熟過(guò)程中，除6 h以外的其余時(shí)間點(diǎn)，Compound C組的糖原含量顯著高于對(duì)照組和AICAR組（P＜0.05）。說(shuō)明AMPK的激活確實(shí)加速了糖原的分解，這與Kurth-Kraczek等[22]證實(shí)AMPK的激活可加速糖原分解，同時(shí)促進(jìn)骨骼肌糖酵解的結(jié)論基本一致。這是由于AMPK可以通過(guò)作用于GS和糖原磷酸化酶以及GLUT4的移位，促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的吸收，抑制肝糖原的異生以及促進(jìn)骨骼肌糖酵解，從而影響肌肉中糖原的含量[23]。

圖7 成熟期間牦牛肉糖原含量的變化Fig.7 Changes of glycogen concent of yak beef during postmortem aging

2.7 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉乳酸的影響

由圖8可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組中乳酸的含量均呈上升趨勢(shì)。在成熟初期（6～12 h），三組乳酸含量呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）；而在成熟后期（72～168 h），三組的乳酸含量非顯著性增加（P＞0.05）。這是由于動(dòng)物宰后，糖酵解產(chǎn)生乳酸，而乳酸不能通過(guò)血液循環(huán)排除或在肝中合成肝糖原，因此大量的蓄積在肌肉中，使其含量逐漸升高[9]。在整個(gè)成熟過(guò)程中，Compound C組的乳酸含量始終低于對(duì)照組和AICAR組。在成熟6～72 h內(nèi)，處理組和對(duì)照組之間乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）；而在成熟后期（120～168 h），AICAR組的乳酸含量顯著高于Compound C組（P＜0.05）。這是由于AMPK的激活會(huì)加快宰后肌肉的糖酵解速率，從而導(dǎo)致AICAR組的乳酸含量高于其余兩組[4]。乳酸的不斷累積是導(dǎo)致宰后肌肉pH下降的主要原因，而宰后胴體pH不正常的降低會(huì)容易出現(xiàn)白肌肉（PSE）肉和黑干肉（DFD），兩種肉外觀顏色均相對(duì)差，嚴(yán)重影響銷(xiāo)售[5]。由此可以推斷，控制宰后肌肉乳酸的積累速率，有利于保護(hù)肉色。

圖8 成熟期間牦牛肉乳酸含量的變化Fig.8 Changes of lactic acid content of yak beef during postmortem aging

2.8 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉LDH活性的影響

LDH是糖酵解和糖異生過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，在輔酶NAD+或NADH輔助下，實(shí)現(xiàn)乳酸和丙酮酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，其活性的降低表明線粒體生理功能隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱[14]。由圖9可知，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組中LDH活性隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。相較于成熟6 h，168 h時(shí)三組LDH的活性顯著下降（P＜0.05），且AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的LDH活性較成熟6 h時(shí)依次下降了36.87%、32.98%和33.67%。說(shuō)明Compound C組LDH活性下降速率慢于AICAR組和對(duì)照組。從整體上來(lái)看，在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，三者LDH活性依次為Compound C組＞對(duì)照組＞AICAR組。并且，除168 h外，在其余時(shí)間點(diǎn)，Compound C組的活性均顯著高于AICAR組（P＜0.05）。說(shuō)明AMPK的激活會(huì)抑制LDH的活性。由于LDH可以促進(jìn)NADH的生成，從而促使還原酶還原MMb，維持肉色的穩(wěn)定性[24]。同時(shí)，Kim等[25]在研究乳酸含量與肉色穩(wěn)定性的關(guān)系中，得出LDH活性與a*值具有較為顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），與MMb相對(duì)含量為顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。因此，可以得出AMPK活性的抑制可以提高LDH的活性，從而能夠維持肉色穩(wěn)定。

圖9 成熟期間牦牛肉LDH活性的變化Fig.9 Changes of LDH activity of yak beef during postmortem aging

2.9 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉己糖激酶活性的影響

己糖激酶在糖酵解過(guò)程中以限速酶的身份存在，因此宰后糖酵解的程度和速度受其活性的影響。由圖10可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組中己糖激酶的活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，與AMPK活性變化趨勢(shì)相同。在成熟初期（6～12 h），三者己糖激酶活性顯著上升（P＜0.05），且AICAR組的己糖激酶活性顯著高于其余兩組（P＜0.05），而Compound C組與對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05）；12 h后，三者己糖激酶活性顯著下降（P＜0.05），且在24～120 h時(shí)間段內(nèi)，對(duì)照組的己糖激酶活性顯著低于AICAR組（P＜0.05），顯著高于Compound C組（P＜0.05）。宰后牦牛成熟過(guò)程中，己糖激酶活性與其AMPK活性變化趨勢(shì)相一致，說(shuō)明AMPK的活性可能影響己糖激酶的活性，從而促進(jìn)糖酵解。Holmes等[26]連續(xù)5 d將AICAR注射入老鼠的體內(nèi)，使AMPK慢慢活化，導(dǎo)致骨骼肌中己糖激酶活性顯著增加，進(jìn)而加速糖酵解的進(jìn)程，該研究結(jié)果證實(shí)了上述猜想。

圖10 成熟期間牦牛肉己糖激酶活性的變化Fig.10 Changes of hexokinase activity of yak beef during postmortem aging

2.10 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉肌酸激酶活性的影響

肌酸激酶與肌肉收縮、能量代謝和ATP合成等過(guò)程都具有一定的相關(guān)性，磷酸肌酸在肌酸激酶的催化下，能夠在動(dòng)物宰后較短時(shí)間內(nèi)對(duì)ATP的消耗起到緩沖作用[9]。由圖11可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組中肌酸激酶的活性均呈先下降后上升趨勢(shì)，在成熟初期（6～12 h），三者肌酸激酶活性逐漸上升；12 h后，三者己糖激酶活性逐漸下降。與AMPK活性變化的趨勢(shì)剛好相反。在整個(gè)成熟過(guò)程中，Compound C組的肌酸激酶活性始終顯著高于AICAR組（P＜0.05）。這是由于AMPK與磷酸肌酸供能體系之間存在一定的相互作用，AMPK可以通過(guò)磷酸化作用實(shí)現(xiàn)對(duì)肌酸激酶活性的抑制[9]。AMPK和磷酸肌酸供能體系都對(duì)ATP濃度的維持具有一定的作用，因此二者之間可能存在動(dòng)態(tài)平衡，在供能方面具有互補(bǔ)性。

圖11 成熟期間牦牛肉肌酸激酶活性的變化Fig.11 Changes of creatine kinase activity of yak beef during postmortem aging

2.11 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉GS活性的影響

由圖12可知，AICAR組和對(duì)照組的GS活性隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升趨勢(shì)，而Compound C組的GS活性則在成熟6～72 h呈無(wú)規(guī)律變化，72 h后呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)成熟階段，三者的GS活性始終為Compound C組＞對(duì)照組＞AICAR組，且在成熟6～24 h，Compound C組和對(duì)照組的GS活性始終顯著高于AICAR組（P＜0.05）。由于在離體骨骼肌細(xì)胞中，激活A(yù)MPK可使己糖激酶和磷酸果糖激酶活化，促使GS失去活性，加快葡萄糖氧化以及糖酵解進(jìn)程，與此同時(shí)糖異生和糖原合成受到抑制[7]。說(shuō)明AMPK活性的激活，會(huì)抑制GS的活性，從而影響糖原含量進(jìn)而影響糖酵解及肉色。

圖12 成熟期間牦牛肉GS活性的變化Fig.12 Changes of GS activity of yak beef during postmortem aging

2.12 AMPK活力對(duì)宰后牦牛肉NADH含量的影響

由圖13可知，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的NADH含量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。這是因?yàn)樵诩∪饨M織中線粒體結(jié)構(gòu)損傷引起的呼吸作用衰退導(dǎo)致NADH含量顯著降低[19]。成熟6 h時(shí)，AICAR組、Compound C組和對(duì)照組的NADH含量分別為342.87、555.24和456.19 ng/g，成熟168 h時(shí)，三者NADH含量依次下降至131.78、306.70和274.75 ng/g。在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組的NADH含量顯著低于Compound C組（P＜0.05），且顯著高于AICAR組（P＜0.05）。由于NADH是MetMbR還原MMb過(guò)程中必不可少的一種輔酶[19]。MetMbR活性受NADH濃度變化的影響，當(dāng)健康畜禽屠宰后胴體中的NADH濃度上升，肌細(xì)胞線粒體中的MetMbR活性也相應(yīng)的有所提高[26]。由此可知，Compound C組MetMbR活性優(yōu)于其余兩組，該結(jié)果與圖6結(jié)果一致。進(jìn)一步說(shuō)明肌肉組織中Compound C抑制AMPK的活化，提高了NADH的含量，使得MetMbR活性有所提高，從而增強(qiáng)了肉色的穩(wěn)定性。

圖13 成熟期間牦牛肉NADH含量的變化Fig.13 Changes in NADH content of yak beef during postmortem aging

2.13 能量代謝指標(biāo)與肉色參數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)

由表2可知，a*值與己糖激酶活性、乳酸脫氫酶活性、糖原含量和NADH含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），與肌酸激酶活性和糖原合成酶活性呈極顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與乳酸含量呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。H*值與肌酸激酶活性、乳酸含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），與GS活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與LDH活性、糖原含量和NADH含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.01）。由于a*值越高，H*值越低，表示肉色越鮮紅，說(shuō)明隨著己糖激酶活性、乳酸脫氫酶活性的提高，糖原含量和NADH含量的增加，肌酸激酶活性和糖原合成酶活性及乳酸含量的下降均能在一定程度上使新鮮牦牛肉保持鮮紅色。結(jié)合前文可知，AMPK活性的抑制能夠提高乳酸脫氫酶活性、NADH含量和糖原含量，并且降低乳酸含量來(lái)維持肉色的穩(wěn)定性。由此可以推斷，在牦牛背最長(zhǎng)肌在成熟過(guò)程中，AMPK活性的抑制通過(guò)增加NADH的含量、糖原含量、乳酸脫氫酶活性及降低乳酸含量來(lái)維持肉色的穩(wěn)定性。

表2 能量代謝指標(biāo)與肉色參數(shù)相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of energy metabolism index and color parameters

3 結(jié)論

Compound C能夠抑制牦牛宰后成熟過(guò)程中AMPK的活性，顯著抑制糖原的降解（P＜0.05），降低乳酸的積累速率，提高GS、肌酸激酶和LDH的活性，增加NADH含量，抑制己糖激酶活性，同時(shí)Compound C組的L*值、b*值、H*值以及MMb含量始終小于對(duì)照組，a*值、TMb、OMb含量和MetMbR活性高于對(duì)照組。由此可知，AMPK活性的抑制有利于牦牛背最長(zhǎng)肌在成熟期間維持肉色的穩(wěn)定。Compound C并不是肉品加工中普遍存在的試劑，要使牦牛肉肉色在宰后成熟期間維持良好的穩(wěn)定性，還需要探究通過(guò)其他途徑對(duì)AMPK的活性進(jìn)行抑制。而代謝壓力和導(dǎo)致細(xì)胞能量失衡的外源性化合物均可以改變AMPK的活性，比如在營(yíng)養(yǎng)匱乏、劇烈運(yùn)動(dòng)或是熱休克條件下都可以將其激活。因此，未來(lái)可以對(duì)以上幾種情況做進(jìn)一步的探究，從而更好的維持肉色的穩(wěn)定性。