基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討樺褐孔菌降血糖功效成分及作用機(jī)制

武建平，李文蘭, ，曲中原, ，孫向明，宋 輝，胡 揚(yáng)，辛科穎，聶承冬

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076）

糖尿病是世界最流行的慢性疾病之一，已經(jīng)發(fā)展為影響人類健康的第三大“殺手”。2019年國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2019年全球20～79歲成年人中約4.63億患糖尿病，占全部人口的1/11，其中我國糖尿病患者達(dá)1.1億，為全球首位[1]。目前，針對糖尿病尚無特效療法，仍以預(yù)防和控制為主。臨床上運(yùn)用二甲雙胍片、阿卡波糖片等西藥治療糖尿病，雖然療效顯著，但都具有較明顯的副作用和藥物依賴性。中醫(yī)整體識病，綜合防治，在防止或減緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[2]?？茖W(xué)研究表明糖尿病的發(fā)生發(fā)展和飲食息息相關(guān)，采用藥膳療法改善糖尿病病癥，輔助治療糖尿病越來越受到認(rèn)可。因此，尋找能預(yù)防和治療糖尿病的藥食兩用中藥已成為研究的熱點(diǎn)。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）是銹革菌科寄生于寒帶白樺樹上藥食兩用的珍貴真菌藥材，主要分布于北美北部、芬蘭、波蘭、俄羅斯、中國黑龍江、吉林長白山等地區(qū)，含有多糖、樺褐孔菌素、萜類、多酚類及木脂素等多種成分[3]。樺褐孔菌具有治療糖尿病、抗癌等作用，被俄羅斯、日本、韓國等國家廣泛認(rèn)可。美國FDA稱其為草藥之王。俄羅斯批準(zhǔn)將其產(chǎn)品作為伏龍芝軍事學(xué)院軍官、士兵的營養(yǎng)餐。樺褐孔菌味苦、氣平、無毒，具有滋陰生津、健脾和胃、滋肝補(bǔ)腎等作用[4]。臨床和藥效學(xué)研究均表明樺褐孔菌具有良好的降血糖功效[5]。張苗等[6]基于糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌通過改善胰島萎縮和降低胰腺細(xì)胞空泡化程度等，起到了調(diào)節(jié)血糖的功效。劉向輝[7]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的水提物和醇提物通過提高小鼠體力和機(jī)體抗氧化能力，調(diào)節(jié)血脂代謝，抑制炎性反應(yīng)，緩解外周神經(jīng)病變等癥狀，對實(shí)驗(yàn)性Ⅱ型糖尿病模型小鼠起到了顯著的降血糖功效；王秋爽[8]研究表明樺褐孔菌提取物對多種造模方法建立的Ⅱ型糖尿病模型大鼠均具有良好的血糖調(diào)節(jié)作用。在此實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌對被破壞的胰島細(xì)胞具有修復(fù)作用。綜上所述，樺褐孔菌降血糖的功效顯著且安全穩(wěn)定，具有極大的保健品開發(fā)價值。但截至目前，樺褐孔菌功效成分研究較為薄弱，質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。故本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9-10]和分子對接模擬實(shí)驗(yàn)對樺褐孔菌的功效成分進(jìn)行篩選，闡明化學(xué)成分-核心靶點(diǎn)-通路相互作用關(guān)系，探究其可能分子機(jī)制，為樺褐孔菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樺褐孔菌主要成分的篩選

從中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）、谷歌學(xué)術(shù)（https://scholar.google.com/）、ScienceDirect（https://www.sciencedirect.com/）、Springer Link（https://link.springer.com）、Pubmed（http://pubmed.com.cutestat.com）[11-12]和TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）等數(shù)據(jù)庫中收集有關(guān)樺褐孔菌文獻(xiàn)，提取樺褐孔菌文獻(xiàn)中化學(xué)成分信息并進(jìn)行整理，去除具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的不同名稱成分，進(jìn)行匯總。再利用

Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com）和ADMETlab（http://admet.scbdd.com）等數(shù)據(jù)庫平臺驗(yàn)證其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，并對其成分分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證[13]，將化合物保存為“SDF”或“MOL2”格式文件，繪制樺褐孔菌化學(xué)成分名稱和成分結(jié)構(gòu)的Excel表，最終得到樺褐孔菌的主要成分。

1.2 樺褐孔菌主要成分降血糖靶點(diǎn)的篩選

利用Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[14]數(shù)據(jù)庫獲取樺褐孔菌中主要成分的作用靶點(diǎn)，設(shè)置參數(shù)，species：Homo sapiens，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，進(jìn)行Swiss Target Prediction，得到各成分靶點(diǎn)，基于Uniprot工具（https://www.uniprot.org）進(jìn)行靶點(diǎn)信息校正，篩選出species為Homo sapiens靶點(diǎn)，再經(jīng)過校對去重后，得到樺褐孔菌主要成分的靶點(diǎn)信息。

樺褐孔菌以“Diabetes”為關(guān)鍵詞，在DisGeNET（v7.0）數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）[15]、GAD數(shù)據(jù)庫[16]、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）[17]中收集降血糖相關(guān)基因，將挖掘得到的基因與藥物靶點(diǎn)基因共同映射，從而篩選出樺褐孔菌降血糖的作用靶點(diǎn)。

1.3 作用靶點(diǎn)-主要成分網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將樺褐孔菌的主要成分和降血糖作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape（3.7.2）軟件[18]，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。并基于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值最大自由度和自由度（free degree）篩選核心網(wǎng)絡(luò)[19]，篩選出樺褐孔菌降血糖的主要成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將樺褐孔菌降血糖作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）[20]，設(shè)置參數(shù)，species：Homo sapiens，得到蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建樺褐孔菌降血糖的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），并基于degree值進(jìn)行排序整理。

1.5 核心靶點(diǎn)富集分析與可視化

采用DAVID 6.8平臺（https://david. ncifcrf.gov/）[21]，對樺褐孔菌降血糖靶點(diǎn)進(jìn)行基因的生物過程（Gene Ontology，簡稱GO）富集分析與信號通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，簡稱KEGG）富集分析，GO富集分析通過GraphPad Prism 8進(jìn)行可視化，KEGG富集分析通過Origin2019對通路進(jìn)行Bubble+Color Mapped圖可視化分析，并使用KEGG映射器構(gòu)建路徑圖（https://www.kegg.jp/kegg/tool/map_pathway2.html）

1.6 分子對接模擬

將1.3項(xiàng)下篩選出的主要成分的“SDF”或“MOL2”格式文件導(dǎo)入Chem3D 18.0進(jìn)行優(yōu)化，統(tǒng)一格式；將1.3項(xiàng)下篩選的主要蛋白靶點(diǎn)通過PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org），選擇其最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并下載其“PDB”格式文件。配體分子導(dǎo)入PyRx軟件[22]進(jìn)行能量最小化處理，選擇“Energy Minimization Parameters”，參數(shù)設(shè)置：Force Fielduff；Optimization Algorithm-Conjugate Gradients；Total number of steps-200；Number of steps for update-1；Stop if energy difference is less than-0.001。蛋白導(dǎo)入Auto Dock Tools，進(jìn)行除水、加氫，原子類型設(shè)為Assign AD4 type。將已進(jìn)行處理的配體分子導(dǎo)入PyRx軟件的Ligands選項(xiàng)；蛋白導(dǎo)入Macromolecules選項(xiàng)，設(shè)置Exhaustiveness: 50，進(jìn)行Run Vina等待計(jì)算結(jié)果[23]。在輸出結(jié)果中，RMSD lower bound和RMSD upper bound越低，Predicted binding Affinity（自由能）的數(shù)值越負(fù)，表明所預(yù)測的大分子和配體之間的結(jié)合力越強(qiáng)，Predicted binding Affinity作為打分系統(tǒng)[22]。

1.7 樺褐孔菌功效成分的分析預(yù)測

對“1.6項(xiàng)”中主要成分的分子對接打分值與各靶點(diǎn)的陽性對照組配體的分子對接打分值進(jìn)行對比[22]，并結(jié)合樺褐孔菌功效成分的相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行篩選，最終得到樺褐孔菌降血糖的功效成分。最后基于PLIP（Protein Ligand Interaction Profiler）識別靶點(diǎn)及其配體之間的非共價相互作用，提供有關(guān)結(jié)合特性的原子級信息[24]，通過PyMOL2.1.1展示其結(jié)合方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌主要成分的篩選

從國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫中收集有關(guān)樺褐孔菌文獻(xiàn)，提取樺褐孔菌文獻(xiàn)中化學(xué)成分信息并進(jìn)行整理匯總，最終確定85個樺褐孔菌的主要成分，見表1。

表1 樺褐孔菌中的化學(xué)成分信息Table 1 Chemical constituents of Inonotus obliquus

續(xù)表 1

2.2 樺褐孔菌主要成分降血糖靶點(diǎn)的篩選

通過Swiss Target Prediction預(yù)測確認(rèn)了各個樺褐孔菌主要成分降血糖相關(guān)靶點(diǎn)，去重，共得到580個基因靶點(diǎn)，見圖1。依據(jù)DisGeNET（v7.0）數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘得到降血糖相關(guān)基因，去重后得到823個，將降血糖相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)基因共同映射篩選出124個樺褐孔菌降血糖的作用靶點(diǎn)。

2.3 作用靶點(diǎn)-主要成分網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以124個降血糖靶基因作為治療糖尿病靶點(diǎn)，建立樺褐孔菌化合物-降血糖靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，由圖1的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到成分中位度數(shù)為40，篩選出大于2倍中位數(shù)的成分，度值（degree）＞80的化合物，一共有20個：25,26-二羥維生素 D（25,26-dihydroxyvitamin D）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、樺褐孔菌烷D（inonotusane D）、樺褐孔菌烷F（inonotusane F）、樺褐孔菌酸（Inonotusic acid）、樺褐孔菌醇A（inonotusol A）、樺褐孔菌醇B（inonotusol B）、樺褐孔菌醇C（inonotusol C）、樺褐孔菌醇D（inonotusol D）、樺褐孔菌醇E（inonotusol E）、樺褐孔菌醇G（inonotusol G）、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、spiroinonotsuoxotriol B、栓菌酸（trametenolic acid）、樺褐孔菌醇（inotodiol）和羊毛甾醇（lanosterol），這些可能是樺褐孔菌中主要的降血糖功效成分。

圖1 樺褐孔菌的成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Compounds-Targets network of Inonotus obliquus

2.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

樺褐孔菌降血糖蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析中共有291個Edge，124個Node，具體見圖2。因Node平均度數(shù)為4，故核心靶點(diǎn)的篩選條件為Degree＞8，最終得到21個核心靶點(diǎn)，這些核心靶點(diǎn)與其余蛋白相互作用更強(qiáng)，在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用，具體核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)見表2。

圖2 樺褐孔菌降血糖蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）Fig.2 PPI network of Inonotus obliquus

表2 核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)Table 2 Core targets and topological parameters

2.5 核心靶點(diǎn)富集分析與可視化

采用DAVID數(shù)據(jù)庫對樺褐孔菌主要成分降血糖靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO富集分析中，細(xì)胞生物過程富集的基因數(shù)較多，F(xiàn)DR值較低，說明樺褐孔菌主要通過調(diào)節(jié)以下生物過程發(fā)揮降血糖作用。根據(jù)FDR＜0.05，篩選出細(xì)胞生物過程（Bioprogress，簡稱為BP，如：對含氧化合物的反應(yīng)、對氮化合物的響應(yīng)、脂質(zhì)代謝過程的正調(diào)控和活性氧代謝過程的正調(diào)控等）1143個，細(xì)胞組成（cell components，簡稱為CC，如：質(zhì)膜、細(xì)胞膜和胞質(zhì)部分等）15個，分子功能（Molecular Function，簡稱為MF，如：G蛋白偶聯(lián)肽受體活性、肽受體活性和胰島素受體底物結(jié)合等）58個，結(jié)果如圖3（根據(jù)Count排序，取前10）。KEGG分析中有89條信號通路（Pathway），其中包括多條降血糖信號通路如Insulin resistance（胰島素抵抗）、Type II diabetes mellitus（II型糖尿?。nsulin signaling pathway（胰島素信號通路）和Type I diabetes mellitus（I型糖尿?。┑?，根據(jù)靶標(biāo)命中數(shù)量進(jìn)行排序，對前15條通路進(jìn)行可視化處理，見圖4。

圖3 樺褐孔菌降血糖靶點(diǎn)生物過程（GO）富集分析Fig.3 Enrichment analysis of anti-tumor target bioprocess（GO）in Inonotus obliquus

圖4 樺褐孔菌主要靶點(diǎn)KEGG富集通路氣泡圖Fig.4 Bubble map of enrichment pathways of the main targets in Inonotus obliquus

根據(jù)KEGG通路分析，89條通路中90%通路均與降血糖相關(guān)。Insulin resistance通路共有11個靶基因；Type II diabetes mellitus通路共有6個靶基因；Insulin signaling pathway通路共有5個靶基因；Type I diabetes mellitus通路共有3個靶基因有治療作用。樺褐孔菌與Type I diabetes mellitus和Type II diabetes mellitus通路信號通路的靶點(diǎn)表示圖，見圖5。

圖5 樺褐孔菌和Insulin resistance信號通路的相關(guān)靶點(diǎn)表示圖Fig.5 Representation of the targets of Inonotus obliquus involved in the Insulin resistance

2.6 分子對接模擬

使用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值（degree）＞80的20個核心成分和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值（degree）＞10的9個潛在蛋白靶點(diǎn)（由于（degree）＜10靶點(diǎn)的接近度中心性均小于0.01，故不對其進(jìn)行分子對接模擬）進(jìn)行分子對接模擬，并對核心靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)的原配體進(jìn)行對照分析。原配體的RMSD和對接結(jié)果的RMSD分別進(jìn)行模型表征對比，并以原配體的打分值作為閾值截?cái)喑龊蜻x化合物的活性范圍，篩選出有效活性成分[25]。經(jīng)PyRx對接，得到的數(shù)據(jù)通過熱圖分析（僅保留Predicted binding Affinity（kcal mol-1）的絕對值最高組）得到圖6，通過圖6數(shù)據(jù)可知打分值中小于6的4個僅占2.50%，9到6之間的92個占57.50%，對接打分中大于等于9的活性成分占64個占40.00%，這很好的說明了樺褐孔菌中的候選活性成分與核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性[23]。

圖6 分子對接分?jǐn)?shù)的熱圖分析（kcal mol-1）Fig.6 Heat maps of molecular docking scores（kcal mol-1）

2.7 樺褐孔菌的功效成分分析

對2.6中20個主要成分通過分子對接進(jìn)行篩選，對主要成分的分子對接打分值與各靶點(diǎn)的陽性對照組配體的分子對接打分值進(jìn)行對比，并結(jié)合樺褐孔菌功效成分的相關(guān)文獻(xiàn)[26]，進(jìn)行篩選，最終得到的19個核心活性成分可作為樺褐孔菌的功效成分，分別 為25,26-dihydroxyvitamin D、inonotusane D、inonotusane F、inonotusic acid、inonotusol A、inonotusol B、inonotusol C、inonotusol D、inonotusol E、inonotusol G、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、inotodiol、lanosterol、spiroinonotsuoxotriol B和trametenolic acid，其結(jié)構(gòu)見圖7。通過總結(jié)活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)都為萜類和甾體類成分，這說明萜類和甾體類成分可做為樺褐孔菌主要的功效成分。通過PLIP工具分析發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的降血糖功效可能是通過氫鍵連接和疏水作用與靶點(diǎn)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，見圖8，圖中僅顯示對接活性中最好的4組成分與靶點(diǎn)結(jié)合作用模式，分別為trametenolic acid-AGTR1、inonotusol BCHRM2、inonotusone B-F2、spiroinonotsuoxotriol B-ADRA2B。19個核心活性成分中，除trametenolic acid外，均為三萜類成分，三萜類化合物是自然界中分布廣泛、結(jié)構(gòu)類型多樣的一類重要的天然產(chǎn)物，具有降血糖、抗腫瘤、抗炎、降血脂等多種生物活性[27]。近年來，三萜類化合物的降血糖活性研究取得了較大進(jìn)展，已成為抗糖尿病藥物研究的重要先導(dǎo)化合物之一[28]。

圖7 樺褐孔菌的功效成分Fig.7 Functional componentsof Inonotus obliquus

圖8 活性蛋白質(zhì)和活性化合物相互作用分析Fig.8 Analysis of the interaction between active proteins and active compounds

trametenolic acid-AGTR1，分子對接打分值為-10.4，其絕對值與原配體（-10.9）打分值的絕對值相近。由PHE-77A、LEU-81A、TRP-84A、VAL-108A、PRO-285A、ILE-288A和TYR-292A殘基產(chǎn)生疏水相互作用，其形成一個大的疏水loop區(qū)，可以保證trametenolic acid穩(wěn)定的嵌入此基團(tuán)；氫鍵連接為TYR-35A、THR-88A、TYR-184A和GLN-267A殘基。有研究表明[29]，在增加能量消耗實(shí)驗(yàn)中，AGTR1缺陷型小鼠表現(xiàn)出飲食誘導(dǎo)的體重增加，肥胖的減弱以及胰島素抵抗減弱。該研究數(shù)據(jù)還表明，AGTR1可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)胰島素抵抗。trametenolic acid本身為α-葡萄糖苷酶抑制劑[30]，推測其在樺褐孔菌中作為AGTR1的抑制劑，調(diào)控脂肪細(xì)胞因子的產(chǎn)生和減少胰島素抵抗的產(chǎn)生。inonotusone B-F2分子對接打分值為-10.4。疏水相互作用殘基為TRP-0A和GLU-192A，形成一個疏水loop區(qū)；氫鍵連接為GLY-193A殘基。相比與前兩組，結(jié)合能力較弱，但此組對接的絕對值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原配體（-5.5）打分值的絕對值，說明也具有開發(fā)價值。inonotusone B本身常被做為α-葡萄糖苷酶抑制劑[31]。在II型糖尿病及其高血糖動物模型實(shí)驗(yàn)中，均觀察到F2表達(dá)上調(diào)[32-33]。說明inonotusone B可能通過調(diào)節(jié)F2，減緩人體血糖的升高。

inonotusol B-CHRM2，分子對接打分值為-10.7，其絕對值大于原配體（-9.4）分子對接打分值的絕對值。由TYR-80A和THR-84A，PHE-181A和THR-187A，TYR-177A、TRP-422A和TYR-426A殘基產(chǎn)生疏水相互作用，分別形成三個疏水loop區(qū)，使inonotusol B嵌入基因穩(wěn)定；氫鍵連接為TYR-80A、ILE-178A和ASN-419A殘基。相對于trametenolic acid-AGTR1試驗(yàn)組，本組由于疏水口袋更多，可保證inonotusol B更穩(wěn)定地在CHRM2中嵌住。inonotusol B可降低經(jīng)過低強(qiáng)度體外沖擊波療法（lowintensity extracorporeal shockwave therapy）治療后II型糖尿病大鼠的CHRM2表達(dá)，表明CHRM2與糖尿病有一定的關(guān)聯(lián)，推測inonotusol B通過降低CHRM2表達(dá)，從而達(dá)到治療糖尿病的目的。

spiroinonotsuoxotriol B-ADRA2B分子對接打分值為-11.6，其絕對值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原配體（-7.0）打分值的絕對值。疏水相互作用殘基為TYR-59B、ALA-60B、THR-274B和TRP-332B，形成一個大的疏水loop區(qū)；氫鍵連接為MET-61B、ARG-150B、ILE-232B、SER-316B、LEU-318B殘基。此組對接有一個極大的疏水口袋，還有5個氫鍵締合，相比前3組而言，本組試驗(yàn)的對接最穩(wěn)定，結(jié)合效果最好?；谂R床統(tǒng)計(jì)和動物實(shí)驗(yàn)表明，ADRB2基因的表達(dá)與2型糖尿病、肥胖癥的產(chǎn)生有直接關(guān)系[34]，說明spiroinonotsuoxotriol B可能通過降低ADRB2表達(dá)，從而直接減少2型糖尿病和肥胖癥的產(chǎn)生。inonotusol B和spiroinonotsuoxotriol B都具有極好的調(diào)節(jié)血糖的潛在能力，但截至目前還未見這兩個成分相關(guān)的降血糖研究報(bào)道，故本課題組后期實(shí)驗(yàn)可能會對其進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接試驗(yàn)揭示樺褐孔菌降血糖的功效成分和作用機(jī)制。通過構(gòu)建樺褐孔菌“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及分子對接試驗(yàn)，篩選得到19個活性成分，分別為25,26-dihydroxyvitamin D、inonotusane D、inonotusane F、inonotusic acid、inonotusol A、inonotusol B、inonotusol C、inonotusol D、inonotusol E、inonotusol G、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、inotodiol、lanosterol、spiroinonotsuoxotriol B和trametenolic acid。有文 獻(xiàn)報(bào)道[31]，在體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價實(shí)驗(yàn)中inonotusone A（IC50值：107.2±5.1）、inonotusone B（IC50值：54.8±3.8）和inonotusone E（IC50值：68.3±2.5）表現(xiàn)出了良好的活性，且IC50值均低于陽性對照的阿卡波糖（IC50值：657.8±42.1）。19個活性成分中有17個 與inonotusone A、inonotusone B和inonotusone E結(jié)構(gòu)極其相似。通過競爭性抑制、非競爭性抑制與反競爭抑制作用等研究還發(fā)現(xiàn)這一類成分與臨床使用藥物阿卡波糖作用模式相同（α-葡萄糖苷酶抑制劑，主要用于調(diào)節(jié)血糖），可作為競爭性抑制劑，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)提供潛在的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。黃盼盼等[35]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌中栓菌酸、樺褐孔菌醇和羊毛甾醇等羊毛甾烷型三萜類成分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有良好的抑制活性，且IC50值均低于陽性對照的阿卡波糖，本文樺褐孔菌的19個活性成分中包括栓菌酸、樺褐孔菌醇和羊毛甾醇，其余成分中15個母核均為羊毛甾烷型三萜類成分，推測均具有降血糖的功效。

由PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出21個樺褐孔菌降血糖的核心靶點(diǎn)，分別為AKT1、AGTR1、ADRA2B、HSP90AA1、TNF、F2、CHRM2、CCR5、NPY2R、NPY1R、OPRM1、LCK、MTNR1B、CCR2、PRKCB、DRD2、PRKCD、PRKCA、S1PR2、IL2、IKBKB。研究發(fā)現(xiàn)小鼠β細(xì)胞中活性AKT1的過表達(dá)實(shí)質(zhì)上影響了胰腺細(xì)胞的大小和功能，可使細(xì)胞大小和總胰島素質(zhì)量顯著增加，同時小鼠葡萄糖耐量提高，對實(shí)驗(yàn)性糖尿病的抵抗力增強(qiáng)[36]。有研究表明在肥胖的嚙齒動物或人類受試者的脂肪組織中觀察到了TNF-α產(chǎn)生增加，其被認(rèn)為是肥胖相關(guān)的胰島素抵抗和II型糖尿病的發(fā)病機(jī)理。說明TNF-α抑制劑可以作用于胰島素抵抗通路，減輕胰島素抵抗和減少II型糖尿病的發(fā)病[37]。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人尿液中的F2與II型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，超出了傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素，對確定重度糖尿病人群可能有用，同時F2也可用于降低II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[38]。有研究指出胰腺中CCR5的表達(dá)與胰島炎、自發(fā)性I型糖尿病以及早期糖尿病有關(guān)，說明可以基于控制CCR5下調(diào)來減緩糖尿病的發(fā)生[39]。研究表明低劑量IL-2的使用在多種臨床環(huán)境中均抑制了有害的免疫反應(yīng)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)IL-2在I型糖尿病患者中，也有相似的抑制免疫作用。IL-2是通過多種內(nèi)在機(jī)制對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行選擇性表達(dá)，調(diào)控I型糖尿病通路，從而達(dá)到了治療I型糖尿病的作用。某些中藥成分也可以加強(qiáng)IL-2的表達(dá)，從而達(dá)到更好的預(yù)防以及治療I型糖尿病的目的[40]。根據(jù)KEGG通路分析，89條通路中90%通路均與降血糖相關(guān)。其中胰島素抵抗通路共有11個靶基因；II型糖尿病信號通路共有6個靶基因；胰島素信號通路共有5個靶基因；I型糖尿病信號通路共有3個靶基因，均與降血糖相關(guān)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具和分子對接模擬試驗(yàn)相結(jié)合的方法，確認(rèn)樺褐孔菌降血糖活性成分，關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，以及推測出其可能分子作用機(jī)制[24,41]。基于文獻(xiàn)大數(shù)據(jù)從樺褐孔菌中篩選出85個樺褐孔菌主要成分及其與降血糖相關(guān)靶點(diǎn)?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確認(rèn)了25,26-dihydroxyvitamin D、

dibutyl phthalate、inonotusane D、inonotusic acid、inonotusol A和inonotusone A等共19個降血糖功效成分，確定AKT1、AGTR1、ADRA2B和HSP90AA1等共21個核心靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)胰島素信號通路與樺褐孔菌降血糖作用密切相關(guān)?；诜肿訉幽M實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的核心靶點(diǎn)和功效成分有極好的結(jié)合活性，分子對接模擬試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其活性成分多為萜類和甾體類成分，與靶標(biāo)多以氫鍵作用和疏水作用方式結(jié)合，推測trametenolic acid、inonotusol B、inonotusone B、spiroinonotsuoxotriol B等19個對接活性較好成分為樺褐孔菌降血糖的核心功效成分，其中栓菌酸、樺褐孔菌醇、羊毛甾醇是目前可測易得，具有代表性的降血糖功效成分[42]。綜上，本研究為樺褐孔菌降血糖功效成分及其作用機(jī)制研究提供了理論參考和線索，為進(jìn)一步控制和評價樺褐孔菌及其相關(guān)保健食品、藥品開發(fā)提供理論支持。