UPLC-MS/MS分析牛肉紅朱橘成熟果實多酚類化合物積累特征

李文云，韓秀梅，柏自琴，羅 懌，王小柯，林 乾，李金強，馬玉華

（貴州省農(nóng)業(yè)科學院果樹科學研究所，貴州貴陽 550006）

柑橘主栽類型主要包括寬皮柑橘、柚類、橙類、檸檬等，不僅果形優(yōu)美、酸甜爽口、香味濃郁，還富含多種生物活性成分，其中多酚類化合物是柑橘最常見的一類生物活性成分[1]。多酚類化合物廣泛存在于根、莖、葉、花、果實和種子中，泛指化學結構中具有苯環(huán)和多個酚基團的一類次生代謝產(chǎn)物的總稱，主要包括類黃酮、木質(zhì)素、香豆素、酚酸、苯醌等[2-4]。多酚類化合物不僅與園藝產(chǎn)品外觀、產(chǎn)量、營養(yǎng)品質(zhì)、抗性和適應性等密切相關，在人體健康方面也發(fā)揮著重要作用，被稱為人體“第七類營養(yǎng)素”，但人體自身不能合成，需從食物中攝取。多酚類化合物通常以抗氧化劑的形式清除人體活性氧自由基、抑制細胞過氧化、保護細胞免受損傷[5]，在調(diào)解免疫活性、改善心血管功能、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌等方面發(fā)揮多重藥理活性，被廣泛應用于功能食品、保健品、貯藏保鮮等領域[6]。隨著社會進步和生活水平的提高，以及對大健康理念的認知加深，消費者更加注重對果實品質(zhì)和功能性成分追求。因此，柑橘多酚類化合物因極具研究和應用價值而被廣泛關注。

牛肉紅朱橘是朱紅橘的自然突變體，其果實呈橘紅色，香味濃郁持久，是貴州地方特色柑橘品種[7-8]。本文以兩個地方特色柑橘種質(zhì)-朱紅橘和紅香柚為對照，利用UPLC-MS/MS比較分析多酚類化合物積累特征并篩選差異代謝物，探索牛肉紅朱橘成熟果實多酚類化合物積累特征，以期為牛肉紅朱橘生產(chǎn)栽培、營養(yǎng)評價和功能性成分挖掘利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉紅朱橘（NRH）、朱紅橘（ZHJ）、紅香柚（HXY） 15年生，均采自貴州省惠水縣爛壩林場，砧木為枳殼，栽培管理條件一致。選擇長勢良好、無病蟲的植株3株，在樹冠外圍不同方位隨機采摘健康、無病蟲的成熟果實，帶回實驗室，用蒸餾水將果面清洗干凈，將果實隨機分成3組，設置3次生物學重復，分離果肉迅速用液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測；甲醇、乙酸、乙腈等 色譜純，均購自國藥集團。

CBM30A超高效液相質(zhì)譜 配有電噴霧離子源（ESI）和Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件，日本島津公司；QTRAP 6500串聯(lián)質(zhì)譜 美國ABI公司； HSS T3 C18色譜柱（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm） 美國Waters。

1.2 實驗方法

1.2.1 代謝物提取 將真空冷凍干燥后的樣品研磨成細碎的粉末，準確稱取100 mg，并加入1.2 mL 70%甲醇溶液。震蕩渦旋混勻，隨后置于4 ℃冰箱過夜浸提，10000×g離心10 min，用注射器吸取上清。過0.22 μm的微孔濾膜于上樣瓶中待測。

1.2.2 代謝物檢測 參照Chen等[9]的方法，詳細檢測方法如下：

液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm）。流動相A相為超純水（含0.04%乙酸），B相為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫梯度為：0 min B相為5%，10 min內(nèi)B相增加至95%，保持95% 1 min，11.00～11.10 min，B相降為5%并平衡至14 min。柱溫設置為40 ℃，進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5500 V，簾氣30 psi，碰撞誘導電離參數(shù)設置為高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用二級譜信息對物質(zhì)進行定性，利用質(zhì)譜峰對物質(zhì)進行峰面積積分[10]。利用R軟件制作聚類熱圖用于分析代謝物相對豐度?；贠PLS-DA（Partial Least Squares Discrimination Analysis，偏最小二乘判別分析）模型，根據(jù)差異倍數(shù)值和VIP值（Variable Importance In Project，變量重要性投影）來篩選差異代謝物。滿足VIP值≥1且Fold Change≥2或Fold Change≤0.05的物質(zhì)即為差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 三個地方種質(zhì)多酚類化合物積累特征分析

聚類熱圖分析結果表明，NRH、ZHJ和HXY明顯區(qū)分開，說明三者代謝物存在明顯差異，且同一種質(zhì)三個生物學重復聚在一起，表明數(shù)據(jù)可靠（圖1）。本研究共鑒定出493種物質(zhì)（其中多酚類化合物約占60%），依次為類黃酮（Flavonoids）163種，酚酸（Phenolic acids）71種，氨基酸及其衍生物（Amino acids and derivatives）55種，木脂素和香豆素（Lignans and Coumarins）35種，脂質(zhì)（Lipids）29種，核苷酸及其衍生物（Nucleotides and derivatives）27種，有機酸（Organic acids）27種，生物堿（Alkaloids）24種，萜類（Terpenoids）5種，醌類（Quinones）1種，鞣質(zhì)（Tannins）1種，其它（Others）55種。

圖1 聚類熱圖分析代謝物相對豐度Fig.1 Metabolites relative abundance analysis by heat map

從熱圖分析結果上我們還可以看出，NRH與ZHJ聚類在一起，相距更近，兩者代謝物種類基本一致，差異主要在含量上；而與HXY代謝物種類和含量差異較大，在熱圖上距離相對較遠。NRH檢測到的物質(zhì)數(shù)量最多（460種），ZHJ次之（457種），HXY最少（409種）。其中毛蕊異黃酮、木犀草素、2'-羥基金雀異黃素、表兒茶素、阿魏酸-4-羥基香豆素、4-羥基-7-氧甲基香豆素鼠李糖苷、7,8-二羥基-5,6,4'-三甲氧基黃酮、澤蘭黃素、芹菜素-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、金雀異黃素-8-C-葡萄糖苷、橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-新橙皮苷-7-葡萄糖苷等多酚類化合物僅在NRH和ZHJ中檢測到。而瑞香素、異莨菪亭、香柑醇、佛手柑內(nèi)酯、花椒素、異歐前胡素、對香豆?；?、飛燕草素、異鼠李素-己糖丙二酸等多酚類化合物僅在HXY中檢測到。

2.2 差異物質(zhì)的鑒別與篩選

火山圖分析結果表明（圖2），NRH和HXY比較組篩選到287種差異代謝物，其中179種下調(diào)，108種上調(diào)。ZHJ和HXY比較組篩選到292種差異代謝物，其中194種下調(diào)，98種上調(diào)。ZHJ和NRH比較組僅篩選到54種差異代謝物，其中42種下調(diào)，12種上調(diào)。

圖2 不同比較組差異代謝物火山圖Fig.2 Volcano plot of differential metabolites in different comparison groups

韋恩圖結果表明（圖3），三個比較組共有的差異代謝物有29種（其中多酚類化合物占83%），具體物質(zhì)信息見表1，其中類黃酮13種，香豆素6種，核苷酸及其衍生物2種，酚酸類2種，其它2種，氨基酸及其衍生物、木脂素、生物堿和醌類各1種。

表1 三個比較組共有差異代謝物Table 1 Common differential metabolites among three comparison groups

圖3 韋恩圖（Venn）展示三個比較組共有和特有差異代謝物Fig.3 Common and unique metabolites among three comparison groups explained by Venn

ZHJ和HXY比較組分別篩選到19種差異代謝物（其中多酚類化合物占42%）（圖3，表2），其中類黃酮、核苷酸及其衍生物、酚酸類、脂質(zhì)和其它類均為3種，生物堿2種，有機酸和氨基酸及其衍生物各1種。NRH和HXY比較組篩選到14種特異代謝物（其中多酚類化合物占57%），其中酚酸類5種，有機酸、類黃酮和脂質(zhì)均為2種，核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、木脂素各1種。ZHJ和NRH比較組篩選到11種差異代謝物（其中多酚類化合物占91%），其中類黃酮5種，酚酸類4種，有機酸1種，木脂素和香豆素1種。

表2 各比較組篩選到的特異代謝物Table 2 Specific metabolites selected in each comparison group

2.3 差異代謝物功能注釋和富集分析

差異代謝物KEGG富集分析表明，NRH vs HXY比較組差異代謝物參與了苯丙烷合成、異黃酮合成、黃烷酮和黃酮醇合成等20個生物過程（圖4A）。ZHJ vs HXY比較組差異代謝物參與了氨基酸合成與降解、氧化磷酸化、丙酸代謝、苯丙烷合成、黃烷酮和黃酮醇合成等20個生物過程（圖4B）。ZHJ vs NRH比較組差異代謝物參與了黃烷酮和黃酮醇合成、?；撬岽x、核黃素代謝、苯丙烷合成、嘧啶合成、嘌呤合成等11個生物合成過程（圖4C）。

圖4 差異代謝物KEGG富集分析Fig.4 Differential metabolites enrichment analysis by KEGG

3 討論

多酚類化合物是廣泛存在于植物體的一類重要的天然抗氧化物質(zhì)，對人體健康發(fā)揮著重要作用[11-12]，目前已經(jīng)鑒定分離出8000余種[13]。多酚類化合物屬于苯丙烷的衍生物，糖酵解途徑和戊酸磷酸途徑生成的中間產(chǎn)物經(jīng)莽草酸途徑形成前體物質(zhì)苯丙氨酸，隨后通過苯丙烷代謝途徑進一步形成類黃酮、木質(zhì)素、香豆素、酚酸、生物堿、鞣質(zhì)等[14-15]。其中類黃酮是多酚類化合物最大一個亞類，也是柑橘研究最廣泛深入的一類生物活性成分，根據(jù)苯環(huán)位置和羥基個數(shù)分為黃烷酮、黃酮、黃酮醇和花青苷等，游離態(tài)的苷元較少，大部分經(jīng)糖基化、異戊烯基化和甲基化等修飾作用以衍生物的的形式存在，如橙皮苷、柚皮苷、柚皮蕓香苷、新橙皮苷等[16-18]。隨著消費者對優(yōu)質(zhì)、健康果品需求不斷升級，該類物質(zhì)積累特征、開發(fā)和創(chuàng)新利用一直是育種者關注的熱點。

多酚類化合物受品種、生長發(fā)育階段、組織部位、生態(tài)條件等內(nèi)在和外在多種因素影響下，共同形成獨特的積累特征[19-20]。其中，品種是影響多酚類化合物組成和含量決定性因素之一，如咖啡酸、食子酸、原兒茶酸、肉桂酸阿魏酸和鞣花酸等酚酸在不同棗品種間存在顯著差異[21]。作為蘋果主要抗氧化成分的多酚類物質(zhì)在各個品種間差異顯著[22]。鄭潔等[23]分析椪柑、砂糖橘、紐荷爾臍橙、雞尾葡萄柚、檸檬、金柑等品種果實中酚酸和類黃酮組分時發(fā)現(xiàn)，椪柑和雞尾葡萄柚果皮總酚含量最高，金柑最低；類黃酮在雞尾葡萄柚果皮中含量最高，其次是椪柑和紐荷爾臍橙。本研究結果表明三個地方特色柑橘種質(zhì)果實中多酚類化合物種類和相對含量呈現(xiàn)出種質(zhì)特異，遺傳背景相似的種質(zhì)，其代謝物種類和相對含量也更為接近。具體表現(xiàn)為同為寬皮柑橘的NRH和ZHJ，代謝物種類和相對含量更為接近，兩者篩選到的差異代謝物較少；兩者與柚類HXY代謝物種類和相對含量差異明顯。進一步說明代謝物種類與種質(zhì)類型間存在密切聯(lián)系。

類黃酮是柑橘果實中含量豐富的一類多酚類化合物，不僅影響果實著色和風味，對果實營養(yǎng)價值也具有重要影響，是果實品質(zhì)的重要組成部分[4]。根據(jù)化學結構類黃酮可分為查爾酮、黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷醇和花青素等，大部分類黃酮苷元（如柚皮素、橙皮素、香葉木素、山奈酚等）形成后，進一步經(jīng)過糖基化、?；图谆刃揎椥纬煞€(wěn)定的產(chǎn)物，柑橘中類黃酮主要修飾方式為糖基化[24]，如檢測到的蕓香柚皮苷、柚皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷等。除檢測到大量的類黃酮糖基化產(chǎn)物外，同樣檢測到在柑橘中特異積累的多甲氧基黃酮（含2個或2個以上甲氧基），如5,6-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮、5,2'-二羥基-7,8-二甲氧基黃酮、單羥基三甲氧基黃酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮和5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮等，這類物質(zhì)在抗炎、抗氧化和抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理作用[25-26]。

除類黃酮外，酚酸類也是本研究中檢測到較豐富的一類化合物，其泛指同一苯環(huán)上有若干個羥基的一類化合物的總稱。柑橘中主要以酰胺、酯或糖苷結合態(tài)存在，游離態(tài)的較少[27]。如本研究中檢測到的香豆酸、芥子酸甲酯、原兒茶酸-4-葡萄糖苷、丁香酸-O-葡萄糖苷、2,5-二羥基苯甲酸-O-己糖苷和1-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖等。

柑橘多酚類化合物種類豐富，從頭合成途徑較長，涉及上下游的多條代謝途徑，如上游的糖酵解、磷酸烯醇式丙酮酸和戊酸磷酸途徑等，下游的莽草酸、苯丙烷、甲羥戊酸等多條生物代謝途徑[28-29]。以及苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）[30]、4-香豆酰-CoA-連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL）[31]、查耳酮合成酶（Chalcone synthase, CHS）[32]和肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）[33]等多個限速酶的作用。各品種間生物活性成分種類和含量的差異，具體是哪些代謝物、代謝途徑、關鍵結構基因或調(diào)解基因起主導作用，還有待從結構基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、環(huán)境調(diào)控、庫源供應等多個層面深入研究。