豪豬腹瀉的細(xì)菌性病原分離及16S rRNA的鑒定

周玉照 張小苗* 張以芳

(1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，大理，671003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201)

豪豬(Hystrixbrachyura)又名箭豬，具有食用、藥用、觀賞和工藝等多方面經(jīng)濟(jì)價值[1-2]。在我國，隨著豪豬規(guī)?；娜斯ゐB(yǎng)殖越來越多，豪豬腹瀉在飼養(yǎng)過程中也經(jīng)常發(fā)生，不僅影響豪豬生長繁殖，而且還會引起仔豪豬死亡，給豪豬養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為此，弄清豪豬腹瀉的病因，對于臨床上對癥治療具有重要的指導(dǎo)意義。

豪豬的抗病能力很強(qiáng)，很少發(fā)生疾病，但是，仔豪豬腹瀉是一種初生仔豪豬的急性致死性傳染病，多發(fā)于7日齡以內(nèi)的仔豪豬，發(fā)病率和死亡率均高[3-5]，其病原菌主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、福氏志賀菌(Shigellaflexneri)和變形桿菌(Proteus)。本試驗從曲靖市某豪豬生態(tài)養(yǎng)殖場采集樣品進(jìn)行鏡檢、鑒別培養(yǎng)、生化試驗、藥敏試驗和16S rRNA鑒定，以期找出引起豪豬腹瀉的病因，為當(dāng)?shù)卦摬〉闹委熖峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從曲靖市某豪豬生態(tài)養(yǎng)殖場無菌采取豪豬腹瀉糞便、肝臟、飲水和飼料樣本22份。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌將采取的豪豬腹瀉樣品分別接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)18 h后，革蘭氏染色鏡檢。根據(jù)鏡檢結(jié)果分別把培養(yǎng)液劃線于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和HE培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h后挑可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢后，接種于普通肉湯純培養(yǎng)。

1.3 生化試驗

取普通肉湯純培養(yǎng)菌液分別加入準(zhǔn)備好的葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、尿素、乳糖、鼠李糖、水楊素、七葉苷和肌醇生化鑒定管中，放置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24—72 h后觀察并記錄結(jié)果。

1.4 藥敏試驗

取純培養(yǎng)菌液(1.5×108cfu/mL)均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上，等稍干后，將藥敏紙片平放在培養(yǎng)基表面，放置恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24—72 h后，觀察并測量抑菌圈直徑[6]。

1.5 16S rRNA鑒定

1.5.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中16S rRNA基因保守序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物(16S rRNA-F、16S rRNA-R)，引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。引物信息見表1。

表1 16S rRNA基因引物Tab.1 Primers for 16S rRNA

1.5.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取純培養(yǎng)的病原菌液總DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原菌的16S rRNA基因片段。PCR反應(yīng)體系共30.0 μL，其中ExTaq0.5 μL，10×ExTaqBuffer 3.0 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.5 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 21.0 μL；PCR反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性5 min；95℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.5.3 16S rRNA基因序列的同源性分析

將PCR產(chǎn)物純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。利用Blast，將分離到的病原菌的16S rRNA基因核苷酸序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢

挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察，在視野中出現(xiàn)散在或成對的革蘭氏陰性桿菌(圖1)。疑似為大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonellasp.)。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似大腸桿菌菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長出大小不一的粉紅色菌落(圖2A)，在HE培養(yǎng)基上生長出黃色或淡黃色菌落(圖2B)，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長出黑色帶金屬光澤的菌落(圖2C)，初步鑒定為大腸桿菌。疑似沙門氏菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長出無色或灰白色的菌落(圖2D)，在HE培養(yǎng)基上生長出大小不等的無色菌落(圖2E)，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長出無色或灰白色的菌落(圖2F)，初步鑒定為沙門氏菌。

2.3 生化試驗

由表2可見，疑似大腸桿菌的菌液在葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、尿素、乳糖、鼠李糖、水楊素和七葉苷生化鑒定管均為陽性反應(yīng)，而在肌醇和蔗糖生化鑒定管中均為陰性反應(yīng)。疑似沙門氏菌的菌液在葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇和鼠李糖生化鑒定管中均為陽性反應(yīng)，在蔗糖、尿素、乳糖、水楊素、七葉苷和肌醇生化鑒定管中均為陰性反應(yīng)。因此確認(rèn)2種致病菌分別是大腸桿菌和沙門氏菌。

表2 豪豬腹瀉的細(xì)菌性病原生化試驗結(jié)果Tab.2 Biochemical test results of bacterial pathogens in porcupine diarrhea

2.4 藥敏試驗

純培養(yǎng)的沙門氏菌對壯觀霉素、阿米卡星、慶大霉素高度敏感，對米諾環(huán)素中度敏感，對氯霉素、林可霉素、菌必治、克林霉素、頭孢呋肟、頭孢孟多、先鋒霉素、鏈霉素和環(huán)丙沙星不敏感；純培養(yǎng)的致病性大腸桿菌對阿米卡星和慶大霉素高度敏感，對其他藥物不敏感，混合感染的病原菌對阿米卡星和壯觀霉素高度敏感，對慶大霉素和環(huán)丙沙星中度敏感，對其他藥物不敏感(表3)。

表3 豪豬腹瀉的細(xì)菌性病原藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Bacterial pathogen susceptibility test of porcupine diarrhea

2.5 16S rRNA鑒定2.5.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的病原菌DNA進(jìn)行16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增，經(jīng)質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳獲得大小約1 500 bp的特異性目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。

2.5.2 16S rRNA基因序列的同源性

將分離到的致病性大腸桿菌和沙門氏菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后送華大基因進(jìn)行核苷酸測序。利用生物軟件，將測序得到的16S rRNA基因堿基序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中的致病性大腸桿菌菌株和腸道沙門氏菌菌株的16S rRNA序列分別進(jìn)行同源性比較。結(jié)果YNQJ haozhu大腸桿菌與其他菌株同源性為99.7%—100.0%，遺傳進(jìn)化與U00096菌株屬同一分支(表4，圖4B)；而YNQJ haozhu沙門氏菌與其他菌株同源性為98.2%，遺傳進(jìn)化與其他菌株屬不同分支(表4，圖4A)。

表4 豪豬腹瀉的致病菌16S rRNA基因序列同源性Tab.4 Sequence homology of 16S rRNA gene of porcupine diarrhea pathogen

3 討論

豪豬的抗病能力強(qiáng)，很少發(fā)生疾病，但是在人工飼養(yǎng)豪豬過程中，如果管理不當(dāng)，如養(yǎng)殖場的環(huán)境衛(wèi)生狀況不良、空氣不流暢、投喂的食物或飲用水不潔凈，以及場地狹小而飼養(yǎng)的豪豬數(shù)量較多等，就有可能使豪豬出現(xiàn)腹瀉，特別是幼齡豪豬，其機(jī)體對疾病的抵抗能力較差，一旦發(fā)生腹瀉，就束手無策，引起大量死亡，帶來慘重的損失[7]。

有研究表明，病原菌引起豪豬腹瀉的現(xiàn)象已經(jīng)十分普遍，其主要的致病菌為大腸桿菌、福氏志賀菌和變形桿菌等[2-5]。本研究從曲靖市某豪豬生態(tài)養(yǎng)殖場采集的樣品中同時分離到致病性大腸桿菌和沙門氏菌，屬于混合感染。

目前，對于病原菌引起的豪豬腹瀉主要通過藥物進(jìn)行治療，但隨著臨床中抗生素的大量使用，使病原菌逐漸產(chǎn)生了一定的耐藥性，所以對病原菌進(jìn)行藥敏試驗分析，有利于臨床中的治療。劉軍等[2]對致病性大腸桿菌引起的豪豬腹瀉的病原菌進(jìn)行了藥敏試驗，結(jié)果病原菌對氟苯尼考、頭孢拉啶和頭孢噻肟高度敏感，對克林霉素磷酸酯、復(fù)方鹽酸環(huán)丙沙星和左氟沙星中度敏感，對青霉素、鏈霉素、硫氰酸紅霉素、林可霉素、氯霉素和白霉素不敏感。張保平等[3]對致病性大腸桿菌引起的豪豬腹瀉的病原菌進(jìn)行藥敏試驗，其病原菌對阿莫西林、吡哌酸、青霉素G、羧芐青霉素和環(huán)丙沙星等耐藥，對頭孢噻肟和諾氟沙星敏感性中等，對頭孢曲松、頭孢噻吩、鏈霉素、萬古霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、先鋒霉素和慶大霉素高敏。楊發(fā)根等[5]對大腸桿菌和變形桿菌引起的豪豬腹瀉的病原菌進(jìn)行藥敏試驗，其病原菌對頭孢曲松鈉高敏，對鏈霉素和多黏菌素中度敏感，對頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢拉啶、紅霉素、新生霉素、青霉素G和強(qiáng)力霉素等耐藥。張鵬飛等[4]對福氏志賀菌引起的豪豬腹瀉的病原菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，病原菌僅對丁胺卡那敏感，對其他所測抗生素均表現(xiàn)為耐藥。而該試驗分離到的混合感染菌對阿米卡星和壯觀霉素高度敏感，對慶大霉素和環(huán)丙沙星中度敏感，對其他藥物不敏感。通過比較，說明不同地區(qū)引起的豪豬腹瀉的病原菌不同，病原菌藥敏試驗結(jié)果也存在差異，所以在臨床治療時注意選擇敏感的藥物進(jìn)行治療，而不能隨便使用藥物。同時，選用一些可促進(jìn)仔豪豬生長和抗病作用的中草藥添加劑(金銀花、艾葉、黃芪、黨參、陳皮、麥芽、甘草或者用纈草、蒲公英、馬齒莧、車前草、石榴皮及地枇杷等)也能對豪豬腹瀉性疾病起到一定治療作用[8]。據(jù)研究顯示[9]，微生態(tài)制劑也可以調(diào)整仔豬腸道內(nèi)環(huán)境，抑制或殺滅病原微生物，進(jìn)而激活機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，從而提高仔豪豬抵抗能力和養(yǎng)殖效益。