四爪陸龜非結(jié)核分枝桿菌感染報(bào)告

陳譚子芃 植廣林 單 芬 黃潤(rùn)基

(廣州動(dòng)物園，廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣州，510070)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

受影響的四爪陸龜屬于華南某動(dòng)物救護(hù)站，該站共有22只成年四爪陸龜。它們的飲食包括飼養(yǎng)區(qū)域內(nèi)自然植被與日常加入的水果和蔬菜，以保證85%的草本植物和蔬菜、10%的水果和5%的蛋白質(zhì)飲食結(jié)構(gòu)[6]。冬眠后(3—4月)，體重在1 150—1 630 g的4只成年個(gè)體(3♀，1♂)表現(xiàn)出厭食、虛弱和嗜睡的跡象。另外，在其后肢的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)和尾巴中觀察到炎癥和水腫。

1.2 樣品

通過用23G針頭和2 mL注射器穿刺后尾靜脈獲得4個(gè)患病個(gè)體的血液樣本，將每個(gè)樣本0.6 mL放入2個(gè)裝有肝素鋰作為抗凝劑的試管中(一次性使用真空肝素鋰采血管，江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司)。一支試管用于確定血液學(xué)參數(shù)，另一支用于血液生化參數(shù)測(cè)定。后者在室溫下放置30—40 min，然后3 000 r/min離心10 min，分離血漿，以避免溶血。將獲得的血漿保存在-20℃直至分析。

1.3 血液學(xué)和血液生化檢測(cè)

血液學(xué)參數(shù)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞體積(PCV)、血紅蛋白質(zhì)量濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和白細(xì)胞差異計(jì)數(shù)。用微量血細(xì)胞比容離心機(jī)以3 000 r/min測(cè)定PCV；通過自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血紅蛋白質(zhì)量濃度。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和白細(xì)胞稀釋液測(cè)定RBC和WBC[7]。在具有Diff-Quick樣染色的血液涂片上對(duì)100個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行差異計(jì)數(shù)。對(duì)血漿樣品進(jìn)行生化分析，這些樣品在宏觀上沒有顯示溶血或血脂。分析指標(biāo)包括總蛋白、尿素、尿酸、葡萄糖質(zhì)量濃度和氯化物、鉀、鈉、鈣、磷的離子濃度，以及血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)活性。通過自動(dòng)分析儀(Catalyst One?，IDEXX，美國)的干式試劑片測(cè)定。

1.4 細(xì)胞學(xué)測(cè)定

用聚維酮-碘消毒，通過細(xì)針穿刺患病個(gè)體的股骨關(guān)節(jié)，抽取滑液樣本。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行涂片并用Diff-Quick染色劑和抗酸染色劑染色。

1.5 尸檢

收集4只四爪陸龜(ID標(biāo)注為C-50、C-51、C-54、C-103)的尸檢數(shù)據(jù)和組織樣品用于組織病理學(xué)檢查和培養(yǎng)。

1.6 組織培養(yǎng)與病理學(xué)

將尸檢中收集的樣品切成3 mL厚的塊，并在體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林中靜置6 h。常規(guī)處理，包埋在石蠟中，切成4 μm厚的組織切片，用蘇木精和伊紅染色。另外，對(duì)觀察到肉芽腫的組織，制作相同厚度的新組織切片，并用抗酸技術(shù)染色以檢測(cè)分枝桿菌。考慮到肉芽腫性病變的細(xì)胞學(xué)特征，將其分為3種類型：嗜異性、組織細(xì)胞性和混合性[8]。

1.7 細(xì)菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定

在室溫下，將用于微生物分析的每個(gè)樣品(1—3 g)在10 mL質(zhì)量濃度1.5%的十六烷基吡啶基氯中去污染1 h。對(duì)于每個(gè)樣品，將1 mL勻漿后的懸浮液轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中，將其在培養(yǎng)管中37℃傾斜溫育，瓶蓋半封閉，經(jīng)過4—5 d，液相蒸發(fā)干燥后，擰緊瓶蓋，在37℃下孵育2個(gè)月。在第1周每天觀察1次培養(yǎng)物，然后每周觀察1次。使用抗酸染色在顯微鏡下檢查所有生長(zhǎng)的菌落。將抗酸菌落在新的培養(yǎng)管中繼代培養(yǎng)，并保存在收集器中直到分型。通過酸化方法提取分枝桿菌酸，并用4-溴苯甲酰基溴衍生化，以反相高效液相色譜法(HPLC)分析分枝桿菌衍生物，并以其峰形的分布及峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰高為指標(biāo)對(duì)分枝桿菌進(jìn)行分型鑒定[9]。

從每個(gè)石蠟塊上切下組織切片(30 μm)，并置于無菌微量離心管中。用1.2 mL的二甲苯萃取除去石蠟，13 000 r/min離心5 min，用1.2 mL無水乙醇萃取2次，從組織沉淀中除去殘留的二甲苯。將樣品離心(13 000 r/min，5 min)，并小心除去乙醇。使用商用DNA提取試劑盒從組織沉淀中提取用于PCR分析的DNA，并使用專為檢測(cè)小分子細(xì)菌而開發(fā)的寬范圍PCR分析法篩選分枝桿菌DNA。采用引物M65-Myco F(5′-GG(G/C/T)CT(G/C)AA(A/G)GG(C/T)GGCATCG-3′)和M65-Myco R(5′-AGGCT(A/G)CCAT(G/C)G(A/T)CTGGTC-3′)[10]擴(kuò)增相對(duì)分子質(zhì)量為65 000的熱休克蛋白(hsp65)基因的137 bp片段。該基因是所有分枝桿菌共有的，比其他靶基因具有更大的可變性，因此足以鑒定遺傳相關(guān)物種。

楚神話中的圖騰崇拜呈現(xiàn)出多樣性。這是楚的同化各種文化和將不同國家的圖騰納入自身圖騰系統(tǒng)的結(jié)果。我們只能從楚祖的姓氏，名稱、頭銜和名譽(yù)中看到楚圖騰組織和概念的復(fù)雜性。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液學(xué)與血液生化

由血液學(xué)結(jié)果(表1)可見，C-51、C-54、C-103單核細(xì)胞增多，但只有C-103的白細(xì)胞升高，這與鳥類(Aves)中炎癥性疾病血液學(xué)單核細(xì)胞和白細(xì)胞同時(shí)增多[11]不一致。盡管在解剖中觀察到動(dòng)物腎臟損害，但其血尿素和尿酸仍在正常范圍內(nèi)，提示腎臟疾病可能很難通過血液生化檢測(cè)確診。ALT在血液生化數(shù)據(jù)中數(shù)值偏高，雖然腎臟病變也是ALT升高的主要原因，但是當(dāng)發(fā)生腎臟疾病時(shí)，這些酶會(huì)在尿液而非血液中釋放，ALT活性升高提示可能肝臟損傷[11]。本次報(bào)告中動(dòng)物表現(xiàn)出AST活性增加，因4只四爪陸龜肝臟、四肢都有壞死病變，可能由敗血癥和內(nèi)毒素血癥引起與組織壞死相關(guān)的AST升高[11]。同時(shí)也觀察到高蛋白血癥，可能與慢性炎癥疾病中的脫水和球蛋白質(zhì)量濃度增加有關(guān)[11]。

表1 四爪陸龜?shù)难簩W(xué)和生化指標(biāo)Tab.1 Hematologic and biochemical values of Testudo horsfieldii with mycobacterial infection

2.2 細(xì)胞學(xué)

關(guān)節(jié)抽吸物的顯微鏡分析顯示，存在大量單核細(xì)胞，形態(tài)上與泡沫反應(yīng)性巨噬細(xì)胞一致，抗酸染色陽性。

2.3 尸檢

尸檢時(shí)，觀察到4只烏龜后肢的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)都有腫脹和浮腫。在肝、肺、脾、心臟、肌肉、腎臟和卵巢中觀察到肉芽腫性病變，其中，肝臟均增大，邊緣呈鈍圓，顏色為黃色至棕色。在尸檢的四爪陸龜中觀察到與內(nèi)臟痛風(fēng)一致的病變。在C-51和C-103中，在腎臟表面和橫截面均可見腎尿酸鹽晶體沉積，與內(nèi)臟痛風(fēng)一致。在被檢龜中，脾臟主觀上增大。在C-50的肌肉筋膜之間的皮下組織和C-50、C-54的心包膜表面的組織中也發(fā)現(xiàn)了尿酸鹽沉淀。在存在數(shù)個(gè)不規(guī)則壞死灶的情況下，C-51和C-103的心房壁厚度在主觀上都增加了。C-51和C-54的肺部大量充血，大量的白色小結(jié)節(jié)隨機(jī)分布在薄壁組織中。在胃腸道中未觀察到明顯損傷。胃中殘留有部分未被消化的草。

2.4 組織病理學(xué)

在4個(gè)尸檢龜中，均觀察到肉芽腫性病變(表2)。在C-51中，受影響最大的器官是脾臟，脾實(shí)質(zhì)被多灶性至合并的組織細(xì)胞性肉芽腫完全取代。在肉芽腫的周圍和囊下空間中有散在的剩余淋巴樣組織受壓(圖1A)。但是心臟、肝臟和腎臟也受到了嚴(yán)重影響，如肝存在典型的組織細(xì)胞肉芽腫，其中央有壞死碎片的核心，核心邊緣是上皮樣巨噬細(xì)胞，再外圍是厚邊緣的多核巨細(xì)胞，更外圍是纖維結(jié)締組織囊(圖1B)。器官中的肉芽腫性病變大多與組織細(xì)胞性或混合性一致。在肺和皮膚中，發(fā)現(xiàn)了多處病灶內(nèi)菌絲豐富的真菌性肉芽腫。

在C-50中，受影響較大的器官是肌肉、皮膚和肝臟。在肌肉和肝臟中，主要是組織細(xì)胞性肉芽腫，而在皮膚中，組織細(xì)胞性肉芽腫和混合性肉芽腫以及異嗜性肉芽腫都被檢測(cè)到。

在C-54中，卵巢、肝和肺顯示出散在的異嗜性和混合性肉芽腫。

在C-103中，脾臟的結(jié)構(gòu)完全消失，并被組織細(xì)胞性肉芽腫和混合性肉芽腫所取代。腎臟、肝臟和心臟也有多發(fā)性肉芽腫，既有組織細(xì)胞性的又有混合性的。

在所有樣本中，抗酸染色均顯示肉芽腫性病變中存在可變數(shù)量的耐酸生物，抗酸結(jié)果陽性，分枝桿菌同時(shí)存在于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并分散在肉芽腫的壞死中心。

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)和PCR

延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間(10周)，隨后進(jìn)行HPLC分析，得出1種霉菌酸模式，類似于非結(jié)核分支桿菌。所有抗酸陽性標(biāo)本均產(chǎn)生了預(yù)期大小的DNA片段。為了進(jìn)一步鑒定感染的分枝桿菌菌株，直接對(duì)hsp65的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。4只四爪陸龜標(biāo)本在氨基酸水平(44個(gè)氨基酸殘基)上與結(jié)核分枝桿菌的hsp65序列顯示出最高的相似性。在所有4種樣本下均確定了物種級(jí)別的明確分類；序列分析顯示與非結(jié)核分支桿菌的相應(yīng)序列具有100%的相似性。

3 討論

傳染病可導(dǎo)致圈養(yǎng)爬行動(dòng)物的大量死亡，如果在早期診斷，可以適當(dāng)治療。革蘭氏陰性細(xì)菌是最常與傳染病有關(guān)的病原體，而革蘭氏陽性菌(如分枝桿菌)很少與爬行動(dòng)物的疾病相關(guān)[14]。分枝桿菌在水中無處不在，爬行動(dòng)物感染通常是不適當(dāng)?shù)奶幚?應(yīng)力，溫度、濕度和營養(yǎng)不足)所致[15]。盡管這是一種罕見的疾病，但據(jù)Mitchell[15]報(bào)道相比于其他爬行動(dòng)物該病更常見于龜類。

分枝桿菌感染可能會(huì)出現(xiàn)各種臨床體征和病變，具體取決于物種以及受影響的器官和系統(tǒng)。本研究中的四爪陸龜受到肉芽腫性病變的影響，肉芽腫性病變位于后肢、尾巴、肝臟、肺、心臟、腎臟、脾臟和卵巢的遠(yuǎn)端。

由于缺乏特定的臨床體征，爬行動(dòng)物中的分枝桿菌病的臨床診斷可能很困難。所有肉芽腫性病變伴有體重減輕的情況下，都應(yīng)考慮感染分枝桿菌[15]。

許多細(xì)菌、真菌和寄生蟲感染爬行動(dòng)物傾向于發(fā)展為肉芽腫性炎癥，根據(jù)病因，宿主的細(xì)胞反應(yīng)、外在因素(例如溫度和病程的慢性)可將其分為嗜異性、組織細(xì)胞性或混合性感染[8]。在急性分枝桿菌病中，干酪樣病變主要與嗜異性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。在慢性分枝桿菌病中，典型的肉芽腫性炎癥伴隨結(jié)節(jié)的發(fā)展。隨著時(shí)間的流逝，肉芽腫的發(fā)展范圍從致密的嗜異性粒細(xì)胞聚集和中央壞死，到更復(fù)雜的肉芽腫，其中包含被大量巨噬細(xì)胞包圍的干酪樣中心，上皮樣細(xì)胞和多核巨細(xì)胞，以及淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。這些通常由致密的纖維囊在周圍界定。在四爪陸龜中觀察到的肉芽腫大多是組織細(xì)胞性的，但也有混合性的。這些動(dòng)物可能在冬眠時(shí)已被感染，因此分枝桿菌感染變得相當(dāng)慢性[15]。

四爪陸龜C-51還表現(xiàn)出多發(fā)性真菌性嗜異性肉芽腫和混合性肉芽腫，并伴有病灶內(nèi)菌絲。陸龜?shù)恼婢』疾÷仕坪踺^低，但環(huán)境溫度低和免疫力低下的動(dòng)物通常被認(rèn)為具有潛在感染可能[16]。在本研究中，因?yàn)閯?dòng)物脾、肝和腎被大量分枝桿菌肉芽腫嚴(yán)重破壞，應(yīng)該會(huì)影響免疫力，所以這可能是機(jī)會(huì)性真菌感染。

分枝桿菌在爬行動(dòng)物中的傳播方式尚不清楚?；加屑∪夤趋篮兔庖呦到y(tǒng)疾病的動(dòng)物更容易感染，其他風(fēng)險(xiǎn)因素包括應(yīng)力、營養(yǎng)失調(diào)和慢性疾病，以及皮膚損害(包括微芯片應(yīng)用)也被認(rèn)為是分枝桿菌感染的重要因素[15]。在報(bào)告中的四爪陸龜在冬眠期，白細(xì)胞值處于最低水平，使它們更容易受到感染。嚙齒動(dòng)物(如鼠)咬傷龜，會(huì)引起皮膚的病變，增加分枝桿菌感染的概率，特別是在休眠期間動(dòng)物更容易感染，咬傷通常使龜外殼、四肢和尾巴等較遠(yuǎn)端部位出現(xiàn)病變，但本報(bào)告中四爪陸龜未觀察到此類跡象。口腔和口腔的病變已被認(rèn)為可增加爬行動(dòng)物的感染[16]，但是，這不太可能在本報(bào)告的四爪陸龜中起作用，因?yàn)樵谄渖囝^和胃腸道中均未觀察到病變。

爬行動(dòng)物通常被當(dāng)作寵物飼養(yǎng)。當(dāng)被感染的動(dòng)物沒有臨床癥狀時(shí)，一般不予治療，則可能會(huì)將疾病傳播給人類，且傳播的風(fēng)險(xiǎn)更高[5]。對(duì)爬行動(dòng)物分支桿菌感染的治療局限于使用異煙肼、乙胺丁醇、利福平或阿米卡星等，由于人畜共患病的可能性和治療的困難性，在全身性分枝桿菌感染的病例中應(yīng)考慮安樂死。

綜上，盡管非結(jié)核分枝桿菌感染在爬行動(dòng)物中很少見，但有必要采取嚴(yán)格的衛(wèi)生和預(yù)防措施，尤其是對(duì)于具有較高生態(tài)價(jià)值的受嚴(yán)格保護(hù)的物種。如果將圈養(yǎng)的動(dòng)物用于再引進(jìn)項(xiàng)目，則控制措施應(yīng)更加嚴(yán)格，以防止病原體在野生種群中引入和傳播。