TRPM7和GATA6蛋白在卵巢漿液性腺癌中的表達及意義*

劉 怡，奚 衛(wèi)，許 鵬，談宗國，薛佩佩△

1.重慶市人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院/國家衛(wèi)生計生委出生缺陷與生殖健康重點實驗室，重慶 400020；2.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院，重慶 404000

卵巢癌是一種常見的惡性腫瘤，多發(fā)于不孕不育、有家族史及絕經(jīng)后女性。近年來，對卵巢癌的發(fā)病機制及診斷治療已有較多研究，但由于人口基數(shù)大，以及生活環(huán)境、生活壓力等改變，卵巢癌發(fā)病率和病死率仍保持較高水平[1]，其中卵巢漿液性腺癌是卵巢癌中最常見的組織學(xué)類型[2]。探討新的卵巢漿液性腺癌生物標(biāo)志物對提高治療效果及改善患者預(yù)后有重要意義。LEE等[3]研究報道，膀胱癌組織中瞬時受體電位M7通道(TRPM7)蛋白表達明顯高于癌旁組織，與患者復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移等預(yù)后顯著相關(guān)，TRPM7下調(diào)在膀胱癌細(xì)胞凋亡中起重要作用。DENG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，GATA結(jié)合蛋白6(GATA6)在膽管癌中高表達，可促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。由于TRPM7與GATA6在卵巢漿液性腺癌中表達水平及相關(guān)性研究鮮有報道，本研究通過檢測卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7與GATA6蛋白表達水平，并分析二者的相關(guān)性，探討二者在卵巢漿液性腺癌進展中的意義，以期為臨床提高患者生存率提供一定的幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年3月至2015年7月重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院收治的卵巢漿液性腺癌患者79例為卵巢漿液性腺癌組，患者年齡33～75歲，平均(50.36±16.32)歲。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，將入組卵巢漿液性腺癌患者分為Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期48例；根據(jù)病理分級分為低級別27例，高級別52例；根據(jù)是否發(fā)生大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移分為無大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移33例，有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移46例；根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例；根據(jù)是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移60例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織切片及臨床檢查，確診為卵巢漿液性腺癌；(2)臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性腫瘤患者；(2)合并患有其他部位腫瘤者；(3)心、腎、肝臟功能嚴(yán)重不足及精神疾病患者。另選取同期因子宮肌瘤或子宮腺肌病行子宮及卵巢切除術(shù)的患者56例為對照組，經(jīng)病理切片證實無癌變。對照組年齡32～73歲，平均(49.82±14.73)歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 免疫組織化學(xué)染色試劑盒(貨號：GMS80101.2，美國Genmed公司)；鼠抗人TRPM7多克隆抗體、鼠抗人GATA6多克隆抗體(貨號：H00054822-A01、H00047627-A09，臺灣Abnova公司)；羊抗鼠IgG二抗(貨號：170-6516，深圳市安提生物科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(型號：DMI3000，德國徠卡公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 分別于術(shù)中收集卵巢漿液性腺癌組患者癌組織和對照組正常卵巢組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚切片，備用。

1.3.2組織中TRPM7和GATA6蛋白表達水平檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中TRPM7和GATA6蛋白表達水平。嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進行操作。最終所得切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，并采集圖像信息。選取5個視野進行陽性細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色細(xì)胞為TRPM7、GATA6陽性表達細(xì)胞。

根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強度進行評分。陽性細(xì)胞百分比：<5%計0分，5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%計4分。染色強度：無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩種記分相乘為染色指數(shù)，據(jù)此進行分級：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為陽性(++)；9～12分為強陽性(+++)。其中，定義-、+為低表達，++、+++為高表達。

1.4隨訪 所有入組的卵巢漿液性腺癌患者經(jīng)治療出院后，以電話或復(fù)查形式對其進行5年隨訪，每3個月1次，隨訪時間截止至2020年7月。隨訪期間觀察并記錄患者生存情況。隨訪期間有2例患者失訪，隨訪率為97.47%。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者TRPM7和GATA6蛋白表達情況比較 TRPM7蛋白主要表達在細(xì)胞質(zhì)中，GATA6蛋白主要表達在細(xì)胞核中。卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7、GATA6蛋白高表達率均明顯高于正常卵巢組織(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組患者TRPM7和GATA6蛋白表達情況比較

2.2TRPM7、GATA6蛋白表達與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡的卵巢漿液性腺癌患者癌組織中TRPM7、GATA6蛋白表達情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分級高級別、有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者癌組織中TRPM7、GATA6蛋白高表達率分別明顯高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、病理分級低級別、無大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見表2。

表2 TRPM7、GATA6蛋白表達與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系[ n(%)]

注：A顯示正常卵巢組織中TRPM7蛋白呈陰性；B顯示卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7蛋白呈陽性；C顯示正常卵巢組織中GATA6蛋白呈陰性；D顯示卵巢漿液性腺癌組織中GATA6蛋白呈陽性。

2.3卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7、GATA6蛋白表達水平相關(guān)性 卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7蛋白表達與GATA6蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.427，P<0.001)。

2.4TRPM7、GATA6蛋白表達與卵巢漿液性腺癌患者預(yù)后關(guān)系 TRPM7蛋白高表達組患者5年累積生存14例，死亡38例，失訪2例；TRPM7蛋白低表達組患者5年累積生存15例，死亡10例。TRPM7蛋白高表達組患者的5年總生存率為26.92%，明顯低于TRPM7蛋白低表達組患者的5年總生存率(60.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.830，P=0.016)。GATA6蛋白高表達組患者5年累積生存13例，死亡43例，失訪1例；GATA6蛋白低表達組患者5年累積生存16例，死亡5例，失訪1例。GATA6蛋白高表達組患者的5年總生存率為23.21%，明顯低于GATA6蛋白低表達組的患者5年總生存率(76.19%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.150，P<0.001)。見圖2。

圖2 卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7、GATA6蛋白不同表達患者Kaplan-Meier生存分析

2.5卵巢漿液性腺癌患者不良預(yù)后危險因素分析 Cox回歸模型單因素分析結(jié)果顯示，病理分級高級別、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TRPM7蛋白高表達、GATA6蛋白高表達是影響卵巢漿液性腺癌患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TRPM7蛋白高表達、GATA6蛋白高表達是卵巢漿液性腺癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 卵巢漿液性腺癌患者不良預(yù)后的危險因素分析

3 討 論

卵巢癌患者早期無明顯癥狀，可出現(xiàn)腹圍增大、便秘、間歇性腹脹、背痛等癥狀。當(dāng)患者出現(xiàn)持續(xù)性腹痛、腹脹和消瘦時，卵巢癌多已進展至中晚期，而此時多已轉(zhuǎn)移至其他盆腹腔器官，使其他器官功能異常，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和威脅患者生存[6]。故而探尋預(yù)后標(biāo)志物有助于患者病情評估和臨床治療方案的確定。

Mg2+是一種在腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用的陽離子。研究表明，TRPM7作為Mg2+轉(zhuǎn)運體，能夠促進結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可作為結(jié)直腸癌治療靶點[7-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中較高的TRPM7表達與較大腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較高腫瘤惡性程度有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7蛋白高表達率明顯高于正常卵巢組織，且與FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分級高級別、有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與LIU等[9]研究結(jié)果相似，提示TRPM7蛋白可能參與卵巢漿液性腺癌的發(fā)生、發(fā)展。SONG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TRPM7激酶抑制劑TG100-115能顯著減少乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，但對癌細(xì)胞增殖影響不大。但TRPM7在腎細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達，可能通過影響AKT/FOX1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進癌細(xì)胞生長、增殖[11]。這提示卵巢漿液性腺癌中TRPM7亦可能影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促進腫瘤進展。

GATA6蛋白屬于GATA蛋白家族，有研究報道，結(jié)腸癌組織中GATA6蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，可能影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展[12]。刁藝等[13]研究顯示，GATA6在垂體瘤組織中的陽性率高于正常組織，與TNM分期、病理分級、浸潤深度、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征明顯相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與正常卵巢組織相比，卵巢漿液性腺癌組織中GATA6蛋白呈高表達，推測GATA6高表達與卵巢漿液性腺癌發(fā)生有關(guān)。本研究分析其與臨床病理特征的關(guān)系顯示，癌組織中GATA6蛋白高表達率與FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分級高級別、有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)果提示GATA6蛋白高表達可能預(yù)示FIGO分期和病理分級升高、腫瘤轉(zhuǎn)移。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程是影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[14-15]。對前列腺癌的研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)可誘導(dǎo)TRPM7蛋白在前列腺癌細(xì)胞和組織中表達，TRPM7缺乏可通過影響Mg2+水平和逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化狀態(tài)，抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中GATA6表達水平升高，過表達GATA6可增加上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7蛋白表達與GATA6蛋白表達呈正相關(guān)，提示TRPM7與GATA6蛋白表達可能均與TGF-β誘導(dǎo)有關(guān)，二者可能通過促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，參與卵巢漿液性腺癌的進展。

國內(nèi)外研究顯示，TRPM7、GATA6在肺癌中高表達，是影響患者預(yù)后的危險因素，可作為肺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示，TRPM7、GATA6蛋白高表達組患者5年總生存率均低于二者的低表達組，提示臨床應(yīng)密切關(guān)注TRPM7、GATA6蛋白高表達患者的異常表現(xiàn)，以采取有效治療措施，改善預(yù)后。研究進一步分析顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TRPM7蛋白高表達、GATA6蛋白高表達是卵巢漿液性腺癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素。這充分提示TRPM7、GATA6蛋白高表達可能與卵巢漿液性腺癌進展有關(guān)，可能作為預(yù)后標(biāo)志物，為臨床評估患者預(yù)后提供一定理論依據(jù)。但二者在該腫瘤中的具體作用機制尚需進一步實驗驗證，且本研究未選取癌旁組織作為對照，后續(xù)將進一步開展研究。

綜上所述，卵巢漿液性腺癌組織中TRPM7、GATA6表達上調(diào)，與FIGO分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后有關(guān)，TRPM7、GATA6可作為卵巢漿液性腺癌患者預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。