宮腔粘連子宮內(nèi)膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA的表達水平及臨床意義*

伍雯瑩，丁麗君，謝 環(huán)

1.湖北省黃石市婦幼保健院婦女保健科，湖北黃石 435000；2.湖北省黃石市婦幼保健院產(chǎn)科，湖北黃石 435000；3.湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院/三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北宜昌 443000

近年來隨著人工流產(chǎn)、刮宮等宮腔操作增加，宮腔粘連發(fā)生率呈增高趨勢。宮腔粘連的形成可導(dǎo)致月經(jīng)紊亂和繼發(fā)不孕，即使宮腔鏡宮腔粘連切除手術(shù)水平不斷提高，但是術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，妊娠率仍較低[1]。目前宮腔粘連發(fā)病機制尚不十分明確，現(xiàn)有研究認為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在宮腔粘連發(fā)病機制中占有重要地位[2]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是細胞黏附連接的關(guān)鍵成分，在細胞黏附和維持上皮細胞表型中起著重要作用[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，通過分解基底膜纖維連接蛋白、粘連蛋白降解細胞外基質(zhì)，參與EMT過程[4]。血小板源性生長因子-AA(PDGF-AA)是促進成纖維細胞分裂、趨化的細胞因子，在細胞外基質(zhì)合成、降解中均扮演關(guān)鍵角色[5]。目前E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA在宮腔粘連中均有報道，但較少關(guān)注E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連患者療效和預(yù)后的關(guān)系。鑒于此，本研究通過監(jiān)測宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA的表達，追蹤臨床療效和妊娠結(jié)局，探討E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連患者臨床特征、療效和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年6月至2018年7月湖北省黃石市婦幼保健院婦女保健科收治的86例宮腔粘連患者作為宮腔粘連組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)典型月經(jīng)異常、周期性腹痛，經(jīng)宮腔鏡診斷為宮腔粘連；(2)行宮腔鏡手術(shù)治療，術(shù)中取組織病理檢查，結(jié)果完整；(3)有妊娠需求。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮先天畸形；(2)合并生殖器官惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥；(3)病理標(biāo)本不合格、配偶不育、隨訪失聯(lián)者。宮腔粘連組患者年齡27～39歲，平均(34.21±3.26)歲；病因：有刮宮史35例，有子宮內(nèi)膜息肉切除史22例，子宮內(nèi)膜感染16例，雌激素水平降低10例；類型：混合型49例、周邊型37例；Nasr宮腔粘連分級[6]：從峽部粘連(“是”計2分，“否”計0分)、膜狀粘連(“少”計1分，“廣泛”計2分)、致密粘連(“單發(fā)”計2分，“多發(fā)”計4分)、輸卵管開口(“可見”計0分，“單側(cè)可見”計2分，“均不可見”計4分)、管狀宮腔(“是”計10分，“否”計0分)、月經(jīng)類型(“正常”計0分，“少”計4分，“閉經(jīng)”計8分)、孕產(chǎn)史(“無不良孕產(chǎn)史”計0分，“復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”計2分，“不孕”計4分)等方面進行評分，輕度(0～4分)41例，中度(5～10分)25例，重度(11～22分)20例；粘連性質(zhì)：膜性29例，纖維性37例，肌性20例；內(nèi)膜分期：增殖期39例，分泌期47例；子宮發(fā)育：正常62例，異常24例，閉經(jīng)30例。另選擇同期收治的51例輸卵管性不孕患者為對照組，均經(jīng)宮腔鏡排除宮腔粘連，年齡26～41歲，平均(35.02±3.53)歲；內(nèi)膜分期：增殖期26例，分泌期25例。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)獲得湖北省黃石市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1宮腔粘連的臨床治療 宮腔粘連組所有患者均行宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)，取膀胱截石位，硬腰聯(lián)合麻醉，擴陰器擴開陰道，擴宮棒擴張宮頸，置入宮腔鏡，了解子宮、附件粘連情況，針狀電極分離粘連組織，直至宮腔恢復(fù)正常大小和形態(tài)，雙側(cè)輸卵管開口可見為止，術(shù)中應(yīng)輕柔操作，減少宮腔內(nèi)膜損傷。術(shù)中酌情配合腹腔鏡監(jiān)視，根據(jù)粘連部位不同放置“T”或“O”形宮內(nèi)節(jié)育器預(yù)防粘連。術(shù)后使用抗生素預(yù)防感染，雌激素和孕激素人工周期綜合治療，2～3個月后復(fù)查宮腔鏡，恢復(fù)正常后取出宮內(nèi)節(jié)育器。

1.2.2免疫組織化學(xué)方法檢測E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達 取86例宮腔粘連患者手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜組織和51例輸卵管性不孕患者診刮獲取的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制作4 μm切片，二甲苯中脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水洗滌，在108 ℃高壓2 min，3%過氧化氫/甲醇溶液室溫下阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，1%稀釋正常馬血清(北京太陽紅科技有限公司)37 ℃下孵育30 min，阻斷非特異性抗體結(jié)合，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入PDGF-AA多克隆抗體、鼠抗人MMP-9 單克隆抗體、E-cadherin 兔單克隆抗體(均購自Abcam 公司)，37 ℃孵育60 min，4 ℃ 冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次加二抗，37 ℃孵育17 min，PBS沖洗3次，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)(購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)顯色3～5 min，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)顯色3～5 min。再經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水、透明封固，光學(xué)顯微鏡隨機選取5個高倍視野進行觀察，放大倍數(shù)為400倍。以PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判讀：由湖北省黃石市婦幼保健院病理科2名具有副主任職稱的病理醫(yī)師在雙盲條件下獨立采用半定量法進行等級評定[7]，胞質(zhì)和(或)細胞核中有淡黃色至棕色顆粒被定義為陽性。隨機從各組選擇3張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野觀察，先進行染色強度評分(無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)，再進行陽性細胞百分比評分(陰性為0分， <25%為1分，25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分)，染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘的積為免疫反應(yīng)評分(IRS)。IRS判斷標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.2.3宮腔粘連的療效判斷 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：宮腔形態(tài)、月經(jīng)恢復(fù)正常為痊愈，宮腔形態(tài)、月經(jīng)基本恢復(fù)為顯效，宮腔形態(tài)、月經(jīng)未改善或加重為無效。痊愈、顯效均統(tǒng)計為治療有效[8]。

1.2.4預(yù)后隨訪 宮腔粘連患者均定期電話隨訪2年，每3個月1次，了解隨訪期間成功妊娠、分娩情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。Spearman秩相關(guān)分析E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與Nasr分級之間的相關(guān)性；Kaplan-Meier生存曲線分析E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達陰性、陽性的宮腔粘連患者妊娠、成功分娩差異，比較用Log-Rankχ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮腔粘連組、對照組患者子宮內(nèi)膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA的陽性表達率比較 宮腔粘連組患者子宮內(nèi)膜組織中MMP-9、PDGF-AA陽性表達率均高于對照組(P<0.05)，E-cadherin陽性表達率低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 宮腔粘連組、對照組患者子宮內(nèi)膜組織中E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA陽性表達率比較[ n(%)]

2.2E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與宮腔粘連患者臨床特征、療效的關(guān)系 Nasr分級中重度、輸卵管開口不可見、閉經(jīng)、治療無效的宮腔粘連患者的MMP-9、PDGF-AA陽性表達率高于Nasr分級輕度、輸卵管開口單側(cè)或雙側(cè)可見、無閉經(jīng)、治療有效的宮腔粘連患者(P<0.05)，E-cadherin陽性表達率低于Nasr分級輕度、輸卵管開口單側(cè)或雙側(cè)可見、無閉經(jīng)、治療有效的宮腔粘連患者(P<0.05)。膜性宮腔粘連患者的E-cadherin陽性表達率高于纖維性和肌性粘連患者(P<0.05)，纖維性粘連患者和肌性粘連患者之間的E-cadherin陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同宮腔粘連項目和療效的患者E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA陽性表達率比較[ n(%)]

2.3E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA表達與Nasr分級的相關(guān)性 MMP-9、PDGF-AA表達與Nasr分級呈正相關(guān)(r=0.623、0.513，P<0.05)，E-cadherin表達與Nasr分級呈負相關(guān)(r=-0.569，P<0.05)。

2.4E-cadherin、MMP-9及PDGF-AA與宮腔粘連患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間宮腔粘連患者妊娠32例，成功分娩22例，均存活。MMP-9、PDGF-AA陽性表達者妊娠率分別為25.00%、27.27%，MMP-9、PDGF-AA陰性表達者妊娠率分別為60.00%、54.84%，MMP-9、PDGF-AA陽性表達者妊娠率低于MMP-9、PDGF-AA陰性表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin陽性表達者妊娠率(56.25%)高于E-cadherin陰性表達者(25.93%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達陰性、陽性患者分娩率比較(25.93%vs.25.00%；20.00%vs.35.48%；16.36%vs.41.94%)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Log-Rankχ2=0.006、2.303、3.194，P=0.941、0.129、0.074)，見圖2。

圖1 不同E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達宮腔粘連患者妊娠曲線圖

圖2 不同E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達宮腔粘連患者分娩曲線圖

3 討 論

宮腔粘連是子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)障礙最嚴重的并發(fā)癥之一。各種原因引起的子宮內(nèi)膜基底層損傷，可引起內(nèi)膜上皮細胞再生障礙，并向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化和遷移，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)過度沉積，成纖維細胞增生，造成宮腔粘連[9]。EMT、細胞外基質(zhì)沉積是宮腔粘連發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探討與其相關(guān)的分子生物學(xué)機制有助于臨床診斷，為治療提供新的思路和靶點，并對預(yù)后預(yù)測可能起到一定輔助作用。

E-cadherin是鈣黏蛋白家族的一員，在調(diào)節(jié)鈣依賴細胞黏附和細胞連接形成中發(fā)揮不可或缺的作用，E-cadherin細胞質(zhì)尾部可與各種細胞骨架連接，并介導(dǎo)Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等多種下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控上皮細胞發(fā)育、組織器官形成，維持機體穩(wěn)態(tài)，形成黏附性連接等過程，對維持細胞間隙、細胞相互作用穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[10-11]。E-cadherin表達可抑制EMT，促進上皮細胞增殖、分化和遷移，E-cadherin表達缺乏可引起細胞表皮結(jié)構(gòu)異常和EMT進程[12]。MMP-9是調(diào)節(jié)蛋白水解活動、降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，參與胚胎發(fā)育、血管生成、骨骼發(fā)育、傷口愈合、細胞遷移等多種生理過程，MMP-9過表達可誘導(dǎo)EMT過程，促使纖維化疾病進展[13-14]。PDGF-AA是具有多生物學(xué)效應(yīng)的生長因子，屬于血小板源性生長因子14受體家族，具有促使纖維細胞分化增殖、調(diào)控間充質(zhì)干細胞表型轉(zhuǎn)化等作用[15]。PDGF-AA過表達可導(dǎo)致巨噬細胞、上皮細胞和成纖維細胞之間相互作用，誘導(dǎo)EMT和膠原沉積[16-17]。

本研究結(jié)果表明E-cadherin在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中陽性表達率低于對照組，MMP-9、PDGF-AA陽性表達率高于對照組，且E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與Nasr分級、輸卵管開口是否可見、是否閉經(jīng)均有關(guān)，說明E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA參與宮腔粘連的發(fā)生和進展。動物宮腔粘連大兔模型子宮內(nèi)膜組織中E-cadherin mRNA表達降低，給予骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體修復(fù)子宮內(nèi)膜24 h 后E-cadherin mRNA表達顯著升高[18]。體外研究顯示重度宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中MMP-9蛋白表達高于非宮腔粘連患者[19]。紀(jì)意如等[20]指出PDGF-AA參與宮腔粘連進程。E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA與宮腔粘連臨床療效和預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，目前報道十分少見。本研究通過追蹤臨床治療效果和術(shù)后2年內(nèi)妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與療效和預(yù)后均存在關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)為E-cadherin陰性表達、MMP-9和PDGF-AA陽性表達宮腔粘連患者療效差，妊娠率低，說明E-cadherin、MMP-9、PDGF-AA表達與宮腔粘連患者預(yù)后存在密切關(guān)系，可作為預(yù)后評估的參考指標(biāo)。分析其原因為E-cadherin表達缺失，MMP-9、PDGF-AA過表達可加劇細胞外基質(zhì)降解、上皮細胞表型轉(zhuǎn)化和EMT過程，為宮腔內(nèi)膜組織廣泛粘連、纖維化提供良好條件，即便在宮腔粘連分解術(shù)后仍能復(fù)發(fā)和導(dǎo)致較低的妊娠率。

綜上所述，MMP-9、PDGF-AA在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中陽性表達增高，E-cadherin陽性表達降低。MMP-9、PDGF-AA陽性表達及E-cadherin陰性表達與宮腔粘連加重、療效差有關(guān)，可作為宮腔粘連患者預(yù)后評估的潛在生物學(xué)指標(biāo)。