靈芝三萜的提取工藝及其抗氧化研究進(jìn)展

趙佳敏，陳泓鑫，林宇沖，金喆，韓偉

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

靈芝（Ganoderma Lucidum）又名神芝、萬年蕈，是一種多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體。在上古時(shí)期，靈芝被稱為“瑤草”“瑞草”，《神農(nóng)本草經(jīng)》中稱其為“神芝”。靈芝具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功效，可用于治療失眠心悸、心神不寧，其用藥部位為子實(shí)體。靈芝含有萜類化合物等有效成分。本文論述了靈芝三萜的提取工藝及抗氧化特性，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和藥理研究提供幫助。

1 靈芝三萜的藥理作用

自二十世紀(jì)80 年代以來，人們對(duì)于靈芝脂溶性成分的研究已十分廣泛，其中對(duì)于靈芝三萜的藥理研究最受矚目。大量的研究表明，靈芝三萜在抗腫瘤、保肝排毒、抗HIV病毒、降低膽固醇等方面都發(fā)揮著重要作用。

1.1 抗腫瘤作用

靈芝三萜被普遍認(rèn)為直接對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，其作用機(jī)制在于抑制增殖與轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)還能通過抑制細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)散。靈芝三萜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致不同的三萜類物質(zhì)對(duì)于癌細(xì)胞的作用機(jī)制也不同，如子實(shí)體中提取純化的中性三萜對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有活性抑制作用，而且可以誘導(dǎo)人腸癌SW620 的腫瘤細(xì)胞凋亡；酸性三萜則在宮頸癌和肝癌的活性抑制中作用明顯。

1.2 保肝排毒作用

陳潔等通過大量的藥理研究發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜對(duì)于肝臟的纖維化具有保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)中大鼠血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）顯著降低，肝臟病理切片顯示其纖維化程度得到明顯減緩，表明對(duì)肝臟纖維化的治療有明顯療效。王明宇等的研究結(jié)果表明，靈芝子實(shí)體中分離純化得到的靈芝三萜（GT，主要為靈芝酸A）對(duì)于三種不同成分所導(dǎo)致的小鼠肝損傷都具有優(yōu)秀的保肝活性。

1.3 抗HIV病毒作用

靈芝三萜類化合物中的靈芝酸A、靈芝酸B等化合物有顯著的抑制HIV-1 蛋白酶活性的作用。在抗HIV病毒的作用中，靈芝三萜類化合物的作用主要在于通過抑制HIV 病毒吸附宿主細(xì)胞或膜的融合，同時(shí)還抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶、HIV-1蛋白酶等生物成分。

1.4 調(diào)節(jié)血脂作用

衣艷君等在靈芝三萜對(duì)大鼠血脂水平的研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜能夠有效降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清中的膽固醇、低密度脂蛋白等的含量，擁有明顯的調(diào)節(jié)血脂的作用。靈芝中的靈芝酸B、靈芝酸C的衍生物對(duì)于羊毛甾醇或24，25-二羥基羊毛甾醇在生物體內(nèi)合成膽固醇的生物途徑具有有效的抑制作用。

1.5 免疫促進(jìn)作用

林志彬等的研究表明，靈芝中的靈芝酸具有促進(jìn)帶Lewis 肺癌的Guinea 豬體內(nèi)白細(xì)胞介素-2（IL-2）的含量升高的特質(zhì)，并且該靈芝酸還能提高免疫系統(tǒng)內(nèi)NK 細(xì)胞的免疫活性，從而提高生物體的免疫能力；此外，靈芝三萜類化合物還能增加抗體細(xì)胞的分裂分化。

2 靈芝三萜的提取方法

2.1 溶劑浸提

通過熱水浸提植物中的有效成分，是天然產(chǎn)物有效成分常見的提取方法，其原理是固-液萃取。靈芝三萜難溶于水，但易溶于有機(jī)溶劑，利用高溫破壞藥材的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其有效成分溶于溶劑中，但該技術(shù)由于提取時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑用量大，現(xiàn)在采用少，大多采用索氏提取法。

2.2 超臨界CO2提取

靈芝的結(jié)構(gòu)主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素組成，高度的纖維化結(jié)構(gòu)使得其結(jié)構(gòu)緊密，維持力較好，而靈芝有效成分又附著于細(xì)胞壁及其細(xì)胞內(nèi)，難以滲出。在超臨界CO提取過程中，較高的內(nèi)外壓差破壞了細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)，使得有效成分被高效地提取出來。

2.3 亞臨界水提取

亞臨界水提取技術(shù)是在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上、臨界點(diǎn)374℃以下，通過調(diào)節(jié)溫度控制水的介電常數(shù)，從而改變水的極性。在亞臨界下離子水合、離子締合等微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生特殊變化。此外，亞臨界水還可以充當(dāng)酸堿催化劑或反應(yīng)物，在一定條件下，還可以參與大分子生物聚合物的降解及其他反應(yīng)產(chǎn)物的提取。相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法，亞臨界水提取具有無有機(jī)溶液殘留，無需去除有機(jī)溶劑，并且更加環(huán)境友好[10]。

2.4 超聲輔助提取

超聲輔助提取即利用超聲波的空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等綜合效應(yīng)，作用于植物細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，不僅縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，還能避免高溫對(duì)有效成分的影響。該方法應(yīng)用廣泛，不受成分極性、分子質(zhì)量大小的限制，適用于絕大多數(shù)植物有效成分的提取。

2.5 酶輔助提取

酶解法即利用酶的高效性與選擇性，催化分解細(xì)胞中的保護(hù)結(jié)構(gòu)物質(zhì)，通過破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞內(nèi)部成分的擴(kuò)散。任奕在提取靈芝三萜的過程中，利用木瓜蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶的酶解作用使靈芝的細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，降低與原料的結(jié)合力，促使萜類成分浸出。酶的專一性還不會(huì)影響靈芝有效成分的生物活性，保證了有效成分的純度。

2.6 微波輔助提取

微波輔助提取即利用微波加熱提取溶劑。由于微波具有很強(qiáng)的穿透力，可以在反應(yīng)物內(nèi)外同時(shí)、均勻快速地加熱，因此相對(duì)于傳統(tǒng)提取工藝，具有較高的提取效率和速度。微波提取除了能夠快速破壞植物的組織細(xì)胞壁，還可以用來輔助控制提取過程中的溫度和功率，更加適用于天然植物的提取。

3 靈芝三萜的體外抗氧化研究

3.1 DPPH自由基的清除作用

DPPH 即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，具有相對(duì)穩(wěn)定的孤對(duì)電子，在溶于乙醇時(shí)會(huì)顯紫色，同時(shí)在517 nm時(shí)有最大吸收峰。當(dāng)它和能與孤對(duì)電子結(jié)合的抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，溶液的顏色將從紫色變?yōu)辄S色，而這種顏色變化的幅度與抗氧化劑的抗氧化活性呈正相關(guān)，且隨著其濃度的升高而加強(qiáng)。

3.2 羥自由基的清除作用

羥自由基目前被公認(rèn)為是毒性最大、最活潑的一類自由基，有著和結(jié)晶紫互相作用后產(chǎn)生的無色物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致吸光度下降這一特性。利用這一性質(zhì)，可將不同濃度的靈芝三萜與羥自由基反應(yīng)，加入結(jié)晶紫后測(cè)定溶液的吸光度，以檢測(cè)靈芝三萜的抗氧化性。顯而易見，反應(yīng)后溶液吸光度越大，抗氧化劑的抗氧化性就越強(qiáng)。

3.3 超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子在人體內(nèi)有一定數(shù)量存在，不發(fā)生化學(xué)變化且對(duì)人體無害，但與羥基（-OH）結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞，破壞人類機(jī)體功能。

鄰苯三酚在弱堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，產(chǎn)生有色物質(zhì)和超氧陰離子，有色物質(zhì)在320 nm 處產(chǎn)生最大吸收峰，但與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)后，顏色會(huì)發(fā)生改變，因此吸光度也相應(yīng)下降。利用這一特性可以檢測(cè)靈芝三萜對(duì)超氧陰離子的抗氧化能力，而且較小的濃度變化，會(huì)造成超氧陰離子的清除率大幅度上升。

3.4 對(duì)鐵離子還原力的影響

鐵離子從三價(jià)變成二價(jià)，氧化性減弱，溶液顏色從黃色變成藍(lán)綠色，其吸光度也隨之變化，所以可以通過測(cè)定鐵離子溶液的吸光度來間接鑒定靈芝三萜對(duì)鐵離子的還原力。周曉通過多種提取方法進(jìn)行了靈芝三萜濃度與抗氧化能力的研究，結(jié)果顯示，靈芝三萜濃度的增加與鐵離子的還原力呈正相關(guān)。

4 結(jié)束語

靈芝因其突出的藥理作用而價(jià)格昂貴，選取合適的方式提取其有效成分是充分利用資源的途徑，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)大有裨益。近年來，各類新興提取工藝層出不窮，有關(guān)靈芝三萜提取的優(yōu)化方法亦逐漸受到重視。

靈芝三萜的藥用潛力也正在逐步為人類所發(fā)掘，其抗氧化、治療癌癥等作用正處于實(shí)驗(yàn)研究階段。因此，選擇工藝簡(jiǎn)單、提取率高的提取方法可以為靈芝三萜的綜合利用及抗氧化研究提供良好的幫助和理論依據(jù)。