復(fù)方慶大霉素顆粒劑制備與含量測定方法的建立

彭君茹，左儒楠，陳胡羚，李引乾*

(1.拉薩市第一中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，西藏拉薩 850000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

慶大霉素是一種從小單孢子菌屬中生產(chǎn)的具有相似構(gòu)造的多組方氨基糖苷類抗生素[1]，常用其硫酸鹽形式。與其他氨基糖苷類抗生素抗菌機(jī)制類似，均是通過阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常合成，并破壞細(xì)胞膜而發(fā)揮抗菌作用[2]。慶大霉素抗菌譜廣，對多種革蘭氏陽性菌與陰性菌都具有抑菌和殺菌作用[3]。但隨著慶大霉素在臨床中的不合理應(yīng)用，其抗菌活性降低，且長期大量使用可能對腎臟和耳神經(jīng)產(chǎn)生傷害。黃芩苷具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒及消除體內(nèi)毒素、降壓鎮(zhèn)靜、清熱燥濕等多種藥理作用[4]。黃芩苷的加入不僅能降低慶大霉素對耳的毒性，而且能夠減少其耐藥菌株[5]、增強(qiáng)其抗菌活性[6]。硫酸慶大霉素與雙黃連口服液聯(lián)合使用，體外抑菌試驗(yàn)表明，兩者聯(lián)合后抑菌效果加強(qiáng)，呈相加作用[6]。本試驗(yàn)根據(jù)致病機(jī)制和臨床用藥，將兩種藥物按一定的配比制成復(fù)方顆粒劑，并對其含量進(jìn)行測定，以保證藥物含量，提高聯(lián)合用藥的效率，降低慶大霉素在臨床應(yīng)用中的不合理性[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 多殺性巴氏桿菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.1.2 藥品與試劑 硫酸慶大霉素原料藥(含量99.2%)，批號20160916，煙臺只楚藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；黃芩苷原料藥(含量85%)，批號20160922，四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；硫酸慶大霉素對照品(含量90.0%)，批號20160912，中國獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品；黃芩苷對照品(含量95.5%)，批號20160918，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；β-環(huán)糊精，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蛋白胨(批號20160715)、牛肉膏(批號20160716)、瓊脂(批號20160721)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；氯化鈉(批號20160913)、氫氧化鈉(批號20160928)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫水浴鍋(HH-S1)，大連醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子分析天平(BS-210S)，德國賽多利斯sarto-rius股份有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-SⅡ)，濟(jì)南思卓醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；潔凈工作臺100級(SW-CJ-1F)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH-420AS)，由北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；L5紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；旋光儀、制粒篩、標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，江陰市祝塘機(jī)械廠產(chǎn)品；BKH氣流烘干器，河南予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方慶大霉素顆粒劑的制備

1.2.1.1 普通瓊脂平板的制備 瓊脂15 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g，將其溶于1 000 mL蒸餾水內(nèi)，加熱至溶解，待其冷卻到適宜溫度后，無菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后備用。

1.2.1.2 細(xì)菌懸液制備 將9支滅菌的試管分別標(biāo)記為1號～9號管，然后向每支試管內(nèi)加入9 mL生理鹽水。無菌環(huán)境下，用移液槍吸菌液1 mL加入1號試管中，混勻后吸1 mL加入2號試管，按上述方法，稀釋至9號試管。

制備好的普通瓊脂培養(yǎng)皿20套，5號～9號管各標(biāo)記4套。依次從5號～9號管內(nèi)吸取100 μL菌液放入培養(yǎng)皿，用棉簽涂布均勻，37℃培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)為30～300的培養(yǎng)皿，計(jì)算平均值，配成濃度為5×106CFU/mL的菌懸液，于4℃冰箱保存[8]。

1.2.1.3 慶大霉素和黃芩苷最佳比例的確定 保持慶大霉素和黃芩苷的總質(zhì)量不變，設(shè)計(jì)5個濃度梯度，慶大霉素和黃芩苷比例依次為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1。精確稱取相應(yīng)的藥品，分別取對應(yīng)質(zhì)量的黃芩苷溶于蒸餾水用1 mol/mL的氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，至溶液溶解，再加入慶大霉素溶解、過濾除菌。無菌環(huán)境下將制備好的上述5種細(xì)菌懸液，用滅菌棉簽均勻涂布于固體培養(yǎng)皿中；植入牛津杯、加入不同比例的藥物200 μL；每個病原菌做3個樣，37℃培養(yǎng)24 h后，測抑菌圈大小，取平均值，直徑越大效果越佳；當(dāng)直徑相同時以慶大霉素用量最少的為最佳方案。

1.2.2 復(fù)方慶大霉素顆粒劑配方的確定 以慶大霉素為主藥，以黃芩苷為輔藥，待兩者比例確定后加入賦形劑β-環(huán)糊精，根據(jù)獸藥典相關(guān)規(guī)定，確定3種物質(zhì)在該劑型中的配比。

1.2.3 復(fù)方慶大霉素顆粒劑的制備工藝 按上述試驗(yàn)中確定的藥物比例，準(zhǔn)確稱取慶大霉素原料藥、黃芩苷原料藥和β-環(huán)糊精，均勻混合、加入蒸餾水適量，攪拌均勻，使其呈現(xiàn)“握之成團(tuán)、輕拍即散”狀態(tài)。經(jīng)16目制粒篩制備，烘干箱內(nèi)60℃放置30 min，冷卻至室溫過20目篩，即可。

1.2.4 復(fù)方慶大霉素顆粒劑中慶大霉素的含量測定

1.2.4.1 確定合適的波長 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，確定用旋光法測定慶大霉素含量時所用的波長，其波長為589.3 nm[9]。

1.2.4.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取慶大霉素對照品10.028 8 mg，燒杯中加蒸餾水，待溶解后移入100 mL容量瓶，定容后為100 mg/mL慶大霉素溶液。分別吸取1、2、3、4、5、6、7 mL慶大霉素溶液，定容于200 mL容量瓶中分別得0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的慶大霉素溶液。空白對照組是蒸餾水，在確定波長下測上述7個樣品比旋度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為比旋度，縱坐標(biāo)為濃度。

1.2.4.3 回收率試驗(yàn) 按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線中的方法，分別制備質(zhì)量為0.5、1.8、3.5 mg/mL的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白對照組以蒸餾水代替，測定其回收率。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 用測定回收率試驗(yàn)中質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL的樣品，重復(fù)測定6次比旋度之后計(jì)算RSD。

1.2.4.5 精密度試驗(yàn) 用回收率試驗(yàn)中3個樣品，測定日內(nèi)、日間精密度。日內(nèi)精密度測定方法：每隔4 h測定1次，連測3次；日間精密度測定方法：每天測1次，連測3 d；計(jì)算對應(yīng)濃度和平均值RSD。

1.2.4.6 復(fù)方慶大霉素顆粒劑中慶大霉素含量測定 準(zhǔn)確稱取10.046 0 g復(fù)方慶大霉素顆粒劑，于研缽磨碎溶于燒杯內(nèi)，取1 mol/mL的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，完全溶解后轉(zhuǎn)到100 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的復(fù)方慶大霉素顆粒劑藥液(以慶大霉素含量計(jì)算)，2 500 r/min離心30 min，取上清后過濾，直至澄清。取2.5 mL稀釋到100 mL容量瓶，得質(zhì)量濃度是2.5 mg/mL的溶液(以慶大霉素含量計(jì)算)。空白對照以蒸餾水代替，按建立的測定方法，在已確定的波長下掃描，測定其比旋度，每組平行3個樣，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)際濃度，并計(jì)算復(fù)方慶大霉素顆粒劑中慶大霉素的含量。

1.2.5 復(fù)方慶大霉素顆粒劑中黃芩苷的含量測定

1.2.5.1 選擇紫外吸收波長 取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品41.20 mg，燒杯中加蒸餾水使其溶解，用1 mol/mL的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到中性，待完全溶解，轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶，制得質(zhì)量為200μg/mL黃芩苷樣品。吸取10 mL上述液體稀釋到100 mL，得20 μg /mL黃芩苷樣品?？瞻讓φ战M是蒸餾水，190 nm～400 nm處掃描，記錄波長。

1.2.5.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 依次從制備好的200 μg/mL的黃芩苷樣品中吸取0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL,分別用蒸餾水定容至100 mL容量瓶，得濃度為1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白對照為蒸餾水。190 nm～400 nm處測上述7個樣品的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表吸光度，縱坐標(biāo)代表濃度。

1.2.5.3 回收率試驗(yàn) 用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線中方法，制備濃度為2、8、14 μg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白對照組以蒸餾水代替，測定其回收率。

1.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 用測定回收率試驗(yàn)中8 μg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，于確定的波長處重復(fù)測定6次吸光度，之后計(jì)算RSD。

1.2.5.5 精密度試驗(yàn) 取回收率試驗(yàn)中3個樣品，測定日內(nèi)、日間精密度。日內(nèi)精密度測定方法：每隔4 h測定1次，連測3次；日間精密度測定方法：每天測1次，連測3 d；計(jì)算對應(yīng)濃度和平均值RSD。

1.2.5.6 復(fù)方慶大霉素顆粒劑中黃芩苷含量測定 準(zhǔn)確取1 g復(fù)方慶大霉素顆粒劑，研缽磨碎并溶解在燒杯內(nèi)，取1 mol/mL的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH到中性，完全溶解后移到250 mL容量瓶，制200 μg/mL的溶液(以黃芩苷含量計(jì)算)，2 500 r/min離心30 min，取上清后過濾，至澄清。取1 mL上述溶液稀釋至80 mL，得濃度為2.5 μg/mL的黃芩苷樣品，空白對照以蒸餾水代替，依建立的方法，測定吸光度，每組測3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芩苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方慶大霉素顆粒劑制備結(jié)果

慶大霉素∶黃芩苷=1∶1，抑菌圈直徑為26.13 mm±1.42 mm；慶大霉素∶黃芩苷=2∶1，抑菌圈直徑為27.71 mm±1.44 mm；慶大霉素∶黃芩苷=3∶1，抑菌圈直徑為28.16 mm±0.89 mm；慶大霉素∶黃芩苷=4∶1，抑菌圈直徑為29.25 mm±2.1 mm。慶大霉素∶黃芩苷=5∶1，抑菌圈直徑為28.45 mm±0.73 mm。慶大霉素與黃芩苷比例為4∶1時抑菌圈直徑最大，具有良好的抑菌效果，因此4∶1為最佳配比。按中國獸藥典對于黃芩苷和慶大霉素相關(guān)規(guī)定及兩者最佳配比，確定復(fù)方慶大霉素顆粒劑中各組分所占比例分別為慶大霉素10%，黃芩苷2.5%，β-環(huán)糊精87.5%。制備復(fù)方慶大霉素顆粒劑500 g，5袋分裝，每袋100 g。外觀呈淡黃色，其大小為200 μm～1 700 μm。

2.2 復(fù)方慶大霉素顆粒劑中其含量測定結(jié)果

中國獸藥典附錄中記載，旋光法測量慶大霉素含量時所用波長為589.3 nm。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：α=0.205 14C+0.004 6，相關(guān)系數(shù)為0.997 6，表明慶大霉素于0.5 mg/mL～3.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。慶大霉素平均回收率98%～99%(表2)，RSD小于1%，提示回收率良好，可用來測慶大霉素含量。平均比旋度為0.378±0.003，RSD為0.31%，遠(yuǎn)小于2%，表明重復(fù)性良好(表3)。日間和日內(nèi)精密度RSD都小于5%(表4)，該法精密度良好。復(fù)方慶大霉素顆粒劑中慶大霉素含量測定結(jié)果為2.37、2.39、2.44 mg/mL，平均含量為2.40 mg/mL，為標(biāo)示量的96%，符合獸藥典的規(guī)定。

表1 不同濃度慶大霉素溶液的旋光度測定結(jié)果

表2 慶大霉素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 慶大霉素的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 慶大霉素精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同濃度黃芩苷溶液的紫外吸光度測定結(jié)果

2.3 復(fù)方慶大霉素顆粒中黃芩苷含量測定結(jié)果

圖1曲線有2個峰，1個在200 nm處，1個約在276 nm處，200 nm為氫氧化鈉的波峰，則黃芩苷在276 nm有最大吸收峰。黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.064C+0.002 2，其相關(guān)系數(shù)為0.999 8(表5)；說明黃芩苷溶液在1 μg/mL～13 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。黃芩苷平均回收率為98%～102%，RSD均小于1%，回收率良好(表6)，可用于測黃芩苷的含量。黃芩苷重復(fù)性試驗(yàn)中，黃芩苷平均吸光度是0.159 9，RSD是1.50%，小于2%，該法重復(fù)性良好。日間和日內(nèi)精密度RSD均小于5%，該法精密度良好(表7)。復(fù)方慶大霉素顆粒劑中黃芩苷的平均含量為2.43 μg/mL，為標(biāo)示量的97.2%，符合相關(guān)規(guī)定。

表6 黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 黃芩苷精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖1 黃芩苷紫外吸收波譜圖

3 討論

慶大霉素和黃芩苷含量測定方法較多，有紫外分光光度法、旋光儀法、高效液相色譜法(HPLC)等。HPLC方法的建立程序復(fù)雜且操作繁瑣，而使用紫外分光光度法則要求藥物濃度不宜太高，否則會同吸收峰的物質(zhì)所干擾，而無法得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)；旋光法是利用物質(zhì)的旋光性來測定溶液濃度。對于有旋光性的物質(zhì)來說，使用旋光法測定則更有意義。同時旋光法操作簡單快捷，適用于顆粒劑中具有旋光性物質(zhì)的含量測定。用旋光儀法測定慶大霉素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與微生物法、比色皿法無顯著差異，且樣本不需特殊處理，方便快捷，適用于生產(chǎn)要求。對于黃芩苷含量的測定則以紫外分光光度法最為便捷，操作方法簡單，靈敏度高且黃芩苷本身不具有旋光性。同時測定結(jié)果準(zhǔn)確度與精確度高，且和HPLC無明顯差異[10]。本研究通過選擇特定波長，建立一系列含量測定方法，最終確定用紫外分光光度法于276 nm處測定黃芩苷的含量，用旋光法在589.3 nm處測定慶大霉素的含量。

復(fù)方慶大霉素顆粒劑含有黃芩苷和β-環(huán)糊精，二者均不易溶于水，制備過程中會產(chǎn)生一些雜質(zhì)，故配制的復(fù)方慶大霉素顆粒劑溶液中略顯渾濁，因此在制備之前需先采用離心取上清的方法，再進(jìn)行測定含量。另一方面，黃芩苷在水中溶解度較低，水溶液呈酸性，因此在配制相應(yīng)溶液時，需用1 mol/mL的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH至中性，使其溶解完全。

本試驗(yàn)分別采用旋光法和紫外分光光度法測定復(fù)方慶大霉素顆粒劑中慶大霉素和黃芩苷的含量，其檢測結(jié)果精確度較高，可用于兩種成分的含量測定。此外，該方法可為復(fù)方慶大霉素顆粒劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，并為復(fù)方慶大霉素顆粒劑的深入研究奠定了基礎(chǔ)。