外源添加劑對(duì)蘋果中花青苷影響的研究進(jìn)展

孫媛媛

(江蘇省南京市秦淮中學(xué) 江蘇南京 211100)

一、花青苷的概念

花青苷極不穩(wěn)定，主要以水溶性的花青苷形式存在，顏色與pH有關(guān)，pH小于7時(shí)為紅色，pH在7左右時(shí)為紫色，pH大于7時(shí)呈藍(lán)色。目前，有250多種花青素為天然存在的，已確定的有20種，其中常見的有6種植物花青素，即天竺葵色素（Pg）、矢車菊色素（Cy）、飛燕草色素（Dp）、芍藥色素（Pn）、牽?；ㄉ兀≒t）和錦葵色素（Mv）。與花青素結(jié)合的糖主要為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖等單糖和鼠李葡萄糖、槐糖等二糖，花青苷對(duì)人體有著保健作用，因此提高其含量意義重大。

二、目前在蘋果中的研究情況

Shafiq,Singh的研究以7年生克里普斯粉蘋果樹為材料，進(jìn)行噴施處理。噴灑溶液的制作方法是：花青苷合成的中間體肉桂酸、對(duì)香豆酸、苯丙氨酸、L-苯丙氨酸分別溶于50ml95%乙醇中，制備其不同濃度（50-200mg/L）吐溫20（0.01%）作為表面活性劑加入每個(gè)溶液。在開花后170天噴灑每種苯丙酸/生物合成中間體的水溶液，直到徑流，對(duì)照樹保持未噴灑。結(jié)果表明：采前單次噴施L-苯丙氨酸（100mg/L），在果實(shí)成熟前3-4周噴施，最利于克里普斯粉紅蘋果表面花青苷積累。

Zheng Liu等人的研究以富士蘋果的果肉的愈傷組織為材料。樣品處理方法是：培養(yǎng)基中加入（ALA）或不加入（對(duì)照）50mg/L ALA，在黑暗中搖晃培養(yǎng)箱3小時(shí)。愈傷組織分別在光照24、48和72h后收獲，從蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)錄組水平分析外源ALA促進(jìn)華青素積累。GO富集和KEGG分析以及DEGs的花青素代謝途徑表明，ALA誘導(dǎo)花青素生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)變化可能是花青素積累的關(guān)鍵原因。兩個(gè)R2R3-MYB成員MdMYB10和MdMYB9可能參與了通過(guò)愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)調(diào)控花青素生物合成的過(guò)程。此外，通過(guò)對(duì)MATE基因家族成員的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹、表達(dá)模式、表達(dá)水平分析、順式作用元件預(yù)測(cè)和Y1H篩選，發(fā)現(xiàn)MdMYB10和MdMYB9可能激活MdMATE8轉(zhuǎn)錄，調(diào)控ALA處理下花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)。綜上所述，該研究揭示了ALA對(duì)蘋果花青素積累的正轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控因子及其可能的機(jī)制。

Sun等人的研究材料是紅肉蘋果（Malus sieversii f.niedzwetzkyana）的愈傷組織，培養(yǎng)基為MS+4μmol/L6-BA+2μmol/L NAA，愈傷組織接種量為0.3g。愈傷組織的培養(yǎng)條件為16h/8h光照/暗循環(huán)，光照強(qiáng)度為2000-2500L，溫度為24.2℃。紅色愈傷組織每18d傳代一次。研究結(jié)果表明：茉莉酸甲酯可促進(jìn)紅肉蘋果愈傷組織中花青素的合成，其最佳濃度為10-4mol/L。脫落酸對(duì)花青素合成有抑制作用，茉莉酸甲酯可有效緩解其抑制作用，因此茉莉酸甲酯和脫落酸對(duì)紅肉蘋果愈傷組織中花青素的合成有調(diào)節(jié)作用。

Zheng等人以富士蘋果（Malus domenstica Borkh.）果肉的愈傷組織為材料，分別在含有50mg/L5-ALA、1.5mg/L124-EBL、5-ALA+24-EBL、1.0mg/L Brz和5-ALA+Brz的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3h，對(duì)照組用去離子水處理。處理后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到只含MS的新培養(yǎng)瓶中連續(xù)培養(yǎng)72h，誘導(dǎo)黃酮類化合物積累。結(jié)果表明：24-EBL增強(qiáng)了5-ALA誘導(dǎo)的類黃酮合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和TFs的表達(dá)，導(dǎo)致富士肉芽組織中紅色發(fā)育和類黃酮大量積累加快。Brz阻斷了5-ALA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和類黃酮代謝。值得注意的是，5-ALA可與BRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用。因此，BRs參與了5-ALA誘導(dǎo)的花青素和黃酮醇的積累。此外，5-ALA可能還通過(guò)其他途徑調(diào)節(jié)類黃酮代謝。

路靜等人選擇選擇培養(yǎng)30d，株高約5cm，有10-2片葉的健康“嘎拉”蘋果組培苗葉片提取RNA進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示：蔗糖促進(jìn)花青苷積累，先前研究也表明蔗糖促進(jìn)花青苷積累（Ohto et al.2001；Jeong et al.2010；Solfanelli et al.2006）。本試驗(yàn)中以MdSUT2為研究對(duì)象，在擬南芥中異位表達(dá)后，花青苷含量明顯高于野生型，并且處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥可溶性糖總量及蔗糖、葡萄糖的含量均高于野生型；對(duì)“紅星”蘋果果實(shí)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MdSUT2后，注射點(diǎn)周圍花青苷含量明顯高于對(duì)照，沉默MdSUT2之后，注射點(diǎn)周圍花青苷含量則明顯低于對(duì)照，說(shuō)明MdSUT2正調(diào)控花青苷的合成與積累，定量檢測(cè)與花青苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這些基因表達(dá)量上調(diào)，以上說(shuō)明MdSUT2過(guò)表達(dá)后蔗糖及葡萄糖含量增加，糖作為一種信號(hào)分子通過(guò)激活與花青苷合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控花青苷的合成?；ㄇ嘬占翱扇苄蕴菍?duì)于果實(shí)的品質(zhì)及產(chǎn)量至關(guān)重要，該研究提供了一種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控花青苷合成的新思路，為改善蘋果產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)開辟了新方法。

田義等人在摘袋當(dāng)天對(duì)蘋果品種紅富士（Malus domestica Borkh.‘Red Fuji’）果實(shí)噴施50mg/L腐胺。綜合分析認(rèn)為：腐胺處理可以促進(jìn)蘋果果實(shí)著色相關(guān)的特異調(diào)控因子MYB1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)花青苷合成結(jié)構(gòu)基因UFGT表達(dá)，從而促進(jìn)蘋果果皮中花青苷的積累。如果進(jìn)一步優(yōu)化腐胺濃度，有可能將其作為一種蘋果果實(shí)著色調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于生產(chǎn)。

Shafiq,Singh,Khan等人的研究以粉紅蘋果（Malus domestica Borkh.）為材料，濃度為10mmol/L的茉莉酸甲酯進(jìn)行葉面噴施，結(jié)果表明采收之前169天噴10mmol/L的茉莉酸甲酯或在采收前186天噴灑濃度5mmol/L的茉莉酸甲酯利于花青苷積累。

Wang等人的研究以本研究以蘋果（Malus x domestica）的“奧林”的愈傷組織為材料。在MS培養(yǎng)基中添加1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和0.4mg/L6-芐基氨基嘌呤（6-BA），黑暗下培養(yǎng)三天后轉(zhuǎn)移到含0、20或40mM IAA的MS培養(yǎng)基上，以野生型擬南芥為對(duì)照。結(jié)果表明植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞應(yīng)答主要通過(guò)核中的TIR1/AFBAux/IAA-ARF信號(hào)通路。而MdARF2的過(guò)表達(dá)可以抑制蘋果愈傷組織的積累。但MdARF2與MdIAA26之間未發(fā)現(xiàn)互作，說(shuō)明MdIAA26可能與MdARF家族其他成員互作，調(diào)控花青素的積累。

Karagiannis,Michailidis,Skodra,Molassiotis,Tanou的研究以蘋果為試驗(yàn)材料，分別在花期、花期后45天和90天噴施3次30mMSiO2，160天后采樣。結(jié)果表明硅顯著促進(jìn)果實(shí)和葉的花青苷積累。

An等人的研究表明：ABA促進(jìn)花青素合成的可能機(jī)制是MdbZIP44與MdMYB1相互作用，激活MdMYB1介導(dǎo)的花青素合成。在ABA缺失的情況下，MdBT2與MdbZIP44相互作用，使其泛素化并降解，然后負(fù)調(diào)控MdbZIP44誘導(dǎo)的花青素生物合成的增加。相反，ABA會(huì)觸發(fā)MdbZIP44的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)花青素的積累。ABA還可以抑制MdBT2的表達(dá)，釋放MdBT2通過(guò)蛋白降解調(diào)控MdbZIP44，這也有助于ABA誘導(dǎo)花青素的積累。然而，其他成分（X）也可能參與該途徑。

Xie等人表明ALA如何促進(jìn)基因表達(dá)尚不完全清楚。試驗(yàn)未測(cè)外源ALA處理蘋果果皮中血紅素的含量，但觀察到ALA處理上調(diào)了ALAD基因表達(dá)，LA降低了ALAD基因表達(dá)，這與花青素生物合成基因的調(diào)控模式相似。推測(cè)ALA處理可能增加了血紅素含量，血紅素可能作為轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)Myb、bHLH和Wd40基因的表達(dá)，Wd40又上調(diào)PAL、CHS和UFGT等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素在蘋果皮中合成。

Seif El-Yazal，Rady將洋蔥葉提取物作為一種天然、安全的物質(zhì)，可以入侵芽休眠。外源洋蔥提取物可減少開花天數(shù)，提高開花率和果實(shí)產(chǎn)量參數(shù)，與芽裂有關(guān)的化學(xué)成分也有所改善。洋蔥提取物中有參與不同代謝過(guò)程的成分，增加了過(guò)氧化氫、脯氨酸、總游離氨基酸、總吲哚和花青素的生物合成，降低了過(guò)氧化氫酶活性和游離酚含量。因此，洋蔥提取液作為供試液使用時(shí)，能促進(jìn)蘋果芽的破芽，提高蘋果產(chǎn)量。

安建平等人表明，表明通過(guò)基因克隆獲得蘋果MdCRF6，該基因編碼348個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析表明蘋果MdCRF6包含保守的CRF結(jié)構(gòu)域和AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。定量表達(dá)分析結(jié)果顯示MdCRF6受細(xì)胞分裂素和鹽脅迫誘導(dǎo)。EMSA結(jié)果證實(shí)MdCRF6原核表達(dá)蛋白能夠結(jié)合DRE作用元件。MdCRF6轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織表現(xiàn)出抑制花青苷積累和對(duì)鹽脅迫敏感的表型，表明MdCRF6在調(diào)節(jié)花青苷積累和響應(yīng)植物鹽脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

Gao Jiang等人的綜述中指出如下圖所示的花青苷通路。

A：植物花青素的生物合成途徑。蘋果花青素是糖在光照下由糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為戊糖磷酸途徑的一種生化過(guò)程。莽草酸在這一過(guò)程中起著重要的作用，可能通過(guò)苯丙氨酸途徑形成，或在花青素的直接形成。B：通過(guò)苯丙氨酸途徑合成花青素。苯丙氨酸合成后，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、類黃酮3-羥化酶（F3H）、二氫類黃酮4-還原酶（DFR）、花青素合酶（ANS）和糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）催化最終合成花青素。C：本研究列出的相關(guān)路徑模式圖。分別是紅蘋果中促進(jìn)花青素積累的途徑和青蘋果中抑制花青素積累的途徑。

三、結(jié)束語(yǔ)

研究花青苷的代謝途徑，利于開發(fā)出更佳的外源添加劑，目前主要是通過(guò)外源添加、光照等方式提高其含量，促進(jìn)苯丙烷代謝的花青苷合成途徑，花青苷能豐富植物顏色，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提高。