中華管鞭蝦中蝦青素的腸吸收特性研究

賈 喆，許 艷，劉欣妍，張肖瑕，宋 茹

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

蝦青素，又稱蝦黃素、蝦黃質(zhì)，化學(xué)名稱為3，3’-二羥基-4，4’-二酮基-β，β’-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4，相對(duì)分子質(zhì)量為596.86，是一種橙紅色酮式類胡蘿卜素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通過共軛雙鍵形式銜接4 個(gè)異戊二烯單元，同時(shí)兩端有2 個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成的六元環(huán)［1，2］。蝦青素分子2 個(gè)六元環(huán)上的羥基能夠與脂肪酸結(jié)合形成蝦青素脂肪酸酯，根據(jù)結(jié)合脂肪酸數(shù)量的不同，又可以分為蝦青素單酯和蝦青素雙酯，天然蝦青素多數(shù)以酯的形態(tài)存在［3］。蝦青素不溶于水，但能溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，其抗氧化性是β-胡蘿卜素和葉黃素的10 倍，是天然維生素E的100 倍。研究還發(fā)現(xiàn)蝦青素有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用，因此在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［4］。

中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）俗名紅蝦，是一年生底棲甲殼動(dòng)物，外殼較薄并且光滑，呈粉紅色，廣泛分布于中國(guó)黃海南部及印度尼西亞、日本、印度等國(guó)家的海域［5］。中華管鞭蝦味甜鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是中國(guó)重要的海捕蝦之一。目前，中國(guó)對(duì)水產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的蝦下腳料利用率較低，其中30%～50%的蝦下腳料中包括蝦頭、蝦殼等，基本的處理方法是加工成附加值不高的水產(chǎn)飼料。本研究以中華管鞭蝦的蝦殼為原料，對(duì)蝦青素進(jìn)行提取和皂化，通過對(duì)Sprague Dawley 大鼠進(jìn)行單次大劑量灌胃，研究0～12 h 腸道內(nèi)蝦青素的保留情況及吸收特性，旨在為中華管鞭蝦的蝦青素綜合利用及作為功能因子在食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

主要材料與試劑：中華管鞭蝦，購(gòu)于舟山市定海區(qū)華潤(rùn)萬家超市；無水乙醇及其他分析純?cè)噭?gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)；二氯甲烷、甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚為色譜純，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%），購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstor?fer公司。

主要儀器與設(shè)備：LC-LX-HR165A 離心機(jī)，北京力辰科技有限公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，德國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，5 周齡，體質(zhì)量約180～200 g，購(gòu)于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證（1911100056 號(hào)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝦青素的提取與皂化 蝦青素提取參考Song 等［6］方法并適當(dāng)修改，具體如下：新鮮中華管鞭蝦取殼、破碎，按照1∶5 比例加入無水乙醇，37 ℃水浴振蕩提取1 h，然后在6 000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液，沉淀重復(fù)提取2 次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，按1∶2 比例加入石油醚萃取3 次，收集石油醚層，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，避光冷凍干燥24 h，充氮?dú)猓?20 ℃保藏備用。

皂化方法參考Su 等［7］的方法并適當(dāng)修改，具體如下：蝦青素提取物用無水乙醇復(fù)溶，按4∶1 比例加入0.105 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液，5 ℃水浴下皂化2 h，按1∶2.5 加入去離子水終止反應(yīng)。石油醚萃取皂化液3 次至基本無色，合并石油醚層，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，避光冷凍干燥24 h，即為皂化蝦青素，充氮?dú)猓?20 ℃保藏備用。

1.3.2 蝦青素腸吸收 將大鼠隨機(jī)分為空白組、皂化蝦青素組和未皂化蝦青素組，每組12 只，其中皂化與未皂化蝦青素組分別灌胃0.5 mL 皂化蝦青素、未皂化蝦青素（均用玉米油溶解至質(zhì)量濃度60 mg/mL），空白組灌胃等體積玉米油。在灌胃6 h和12 h 后，每組隨機(jī)抽取6 只大鼠，脫頸處死，從空腸、回腸、結(jié)腸分別刮取腸道內(nèi)容物，按照1∶1.5 加入無水乙醇，漩渦震蕩2 min 后提取腸道內(nèi)容物中蝦青素，5 000 r/min條件下離心15 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.3.3 總蝦青素含量測(cè)定 參考Xu 等［8］高效液相色譜法測(cè)定總蝦青素含量：采用C18色譜柱（4.6 μm×250 mm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為甲基叔丁基醚，用90%流動(dòng)相A 和10%流動(dòng)相B 組成混合洗脫劑洗脫15 min，檢測(cè)波長(zhǎng)477 nm。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（1～40 μg/mL）在同樣條件下洗脫，根據(jù)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=23.773x+3.687 5（R2=0.998 5）（其中x為蝦青素濃度；y為波長(zhǎng)477 nm下吸光值）計(jì)算樣品蝦青素含量（μg/g）。

式中，C為樣品中蝦青素濃度（μg/mL）；V為提取液體積（mL）；m為腸道內(nèi)容物質(zhì)量（g）。

1.3.4 游離型和酯型蝦青素含量測(cè)定 參考Yuan等［9］的方法，具體如下：采用C18色譜柱（4.6 μm×250mm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，流動(dòng)相A 為二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水=5∶85∶5.5∶4.5，流動(dòng)相B 為二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水=22∶28∶45.5∶4.5。洗脫條件為：0～10 min 用100% 流 動(dòng) 相A 洗 脫；10～20 min 用0～100%流動(dòng)相B 梯度洗脫；20～35 min 用100%流動(dòng)相B 洗脫，35～45 min 用0～100%流動(dòng)相B 梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為477 nm。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（40 μg/mL）在上述條件下洗脫，提取物中游離型與酯型蝦青素相對(duì)濃度按照式（2）計(jì)算，再根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品蝦青素含量。

式中，C為游離型、酯型蝦青素相對(duì)濃度（μg/mL）；S為游離型或酯型蝦青素總峰面積（mAU·s）；S標(biāo)準(zhǔn)為蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品總峰面積（mAU·s）；C標(biāo)準(zhǔn)為蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 2018 軟件繪制圖形，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)差異性進(jìn)行分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃不同時(shí)間小腸不同部位蝦青素分布及含量比較

大鼠經(jīng)皂化與未皂化蝦青素灌胃6 h 和12 h 后，蝦青素在小腸不同部位的分布及蝦青素含量比較如圖1 所示。由圖1A、圖1B 和圖1C 可知，大鼠經(jīng)皂化、未皂化蝦青素灌胃6 h 后，空腸、回腸、結(jié)腸內(nèi)容物中均未檢測(cè)出蝦青素。灌胃12 h 后，僅在結(jié)腸內(nèi)容物中檢測(cè)出皂化與未皂化蝦青素，其中皂化組結(jié)腸內(nèi)容物中蝦青素含量為（283.221±89.50）μg/g，顯著高于未皂化組的（126.850±40.49）μg/g（P<0.05）（圖1D）。未皂化和皂化中華管鞭蝦蝦青素灌胃大鼠6 h 后，蝦青素經(jīng)過大鼠小腸（十二指腸、空腸、回腸）的過程中可能已有部分被吸收，所以各腸段內(nèi)容物中未檢測(cè)出蝦青素，但是灌胃12 h 后無論是皂化組還是未皂化組均在大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中檢測(cè)到蝦青素，表明大部分蝦青素在結(jié)腸處累積。周慶新等［10］研究發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻源蝦青素酯在十二指腸、空腸、回腸中均有吸收，且以空腸為主，說明不同來源的蝦青素因其結(jié)構(gòu)組成不同，吸收特性也存在差異。

圖1 小腸不同部位蝦青素分布及含量比較

天然蝦青素主要以游離型和酯型2 種形式存在，自然界中游離型蝦青素含量較少，酯型蝦青素根據(jù)蝦青素分子中的羥基與脂肪酸反應(yīng)又可以分為蝦青素單酯和蝦青素雙酯。但是，不同來源的蝦青素其游離型與酯型比例有所不同［11］。中華管鞭蝦蝦青素主要以酯型蝦青素為主，堿皂化可以顯著提高游離型蝦青素含量［12］。類胡蘿卜素在動(dòng)物胃腸道消化酶的作用下，從其蛋白結(jié)合物中分離出來，在十二指腸中與其他脂類物質(zhì)一起經(jīng)膽汁乳化后形成微團(tuán)（乳糜微粒），自由擴(kuò)散到腸壁表面，然后由腸黏膜細(xì)胞吸收［13，14］。由圖1D 可知，結(jié)腸中未皂化蝦青素含量顯著低于皂化蝦青素含量，可能由于未皂化蝦青素中含有大量酯型蝦青素，更易溶于某些脂類物質(zhì)，因此可直接經(jīng)膽汁乳化形成乳糜微粒被腸道吸收，從而造成未皂化蝦青素的初期腸吸收速率高于皂化蝦青素。

2.2 糞便中蝦青素含量

為了進(jìn)一步研究皂化與未皂化蝦青素在大鼠結(jié)腸累積后的吸收特性，大鼠經(jīng)皂化和未皂化蝦青素連續(xù)灌胃14 d，并在最后一次灌胃后收集新鮮排出糞便，提取糞便中總蝦青素，采用高效液相色譜法分析糞便中蝦青素分布，結(jié)果見圖2 所示。皂化和未皂化蝦青素溶劑為玉米油，其中含有一定量類胡蘿卜素，空白組（圖2B）在波長(zhǎng)477 nm 下出現(xiàn)的色譜峰可能與玉米油本身存在一定量類胡蘿卜素有關(guān)。通過比較蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（圖1A）和空白組（圖2B）的液相色譜圖，可以看出蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（全反式）在洗脫時(shí)間4.8 min 左右有蝦青素特征吸收峰，樣品組出現(xiàn)2 個(gè)峰，峰1 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品確定為反式蝦青素，峰2 推測(cè)為9-順式蝦青素。由圖2C 和圖2D 可以看出，大鼠灌胃蝦青素14 d 后，新排出的糞便中可檢出少量蝦青素，但是皂化組與未皂化組蝦青素含量仍存在明顯差異性，表現(xiàn)為皂化組蝦青素色譜峰面積低于未皂化組，說明皂化組蝦青素在結(jié)腸中能夠進(jìn)一步被吸收，因此在糞便中殘留少。

圖2 連續(xù)灌胃14 d 大鼠糞便中蝦青素分布

由圖3 可知，大鼠新排出糞便中皂化與未皂化蝦青素組的蝦青素總量分別為（11.88±1.39）μg/g 和（57.64±0.51）μg/g，皂化組糞便中蝦青素總量顯著低于未皂化組（P<0.05），皂化與未皂化蝦青素組在結(jié)腸中的吸收率分別為95.81%和54.56%，同樣差異顯著（P<0.05），說明中華管鞭蝦的蝦青素提取物經(jīng)過皂化后在結(jié)腸中吸收效果要好于未皂化的蝦青素提取物，這與?sterlie 等［15］和Coral 等［16］報(bào)道游離態(tài)蝦青素可被人體直接吸收利用，而酯化態(tài)蝦青素需要在消化道內(nèi)先被水解成游離蝦青素，然后再以游離態(tài)形式被人體吸收的研究結(jié)果一致。

圖3 連續(xù)灌胃14 d 大鼠糞便蝦青素總量及結(jié)腸中蝦青素吸收率比較

2.3 糞便中游離型與酯型蝦青素分布及含量比較

酯型蝦青素的疏水性強(qiáng)于游離型蝦青素，而雙酯蝦青素的疏水性又強(qiáng)于單酯蝦青素，因此游離型和酯型蝦青素在C18柱洗脫下來順序依次是游離型蝦青素、蝦青素單酯和蝦青素雙酯［17］。由圖4 可知，受玉米油影響，空白組存在類胡蘿卜素雜峰，且位于酯型蝦青素洗脫峰區(qū)域。排除空白組雜峰可以發(fā)現(xiàn)，皂化蝦青素組大鼠糞便僅存在少量游離型蝦青素，而未皂化組大鼠糞便中不僅存在少量酯型蝦青素，還存在游離型蝦青素，而且游離型蝦青素峰面積明顯高于皂化組。

圖4 連續(xù)灌胃14 d 大鼠糞便游離型與酯型蝦青素分布比較

由圖5 可知，皂化蝦青素組大鼠糞便中游離型蝦青素含量為（11.12±0.36）μg/g，未皂化蝦青素組大鼠糞便中游離和酯型蝦青素含量分別為（21.78±3.40）μg/g 和（7.69±0.32）μg/g，相 對(duì) 含 量 分 別 為73.91%和26.09%。周慶新等［10］用雨生紅球藻源蝦青素酯灌胃動(dòng)物24 h 后，檢測(cè)到糞便中蝦青素單酯和雙酯的相對(duì)含量分別為49.76%和4.46%，合計(jì)為54.22%，游離型蝦青素相對(duì)含量為45.78%。本研究未皂化蝦青素組大鼠糞便中酯型蝦青素相對(duì)含量只有26.09%，低于文獻(xiàn)報(bào)道的54.22%，可能是因?yàn)椴煌瑏碓吹奈r青素酯消化吸收率不同，也可能與未皂化蝦青素中酯型蝦青素在結(jié)腸微生物發(fā)酵作用下轉(zhuǎn)化生成大量游離型蝦青素有關(guān)，因此，中華管鞭蝦的未皂化蝦青素在結(jié)腸中吸收和轉(zhuǎn)化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖5 連續(xù)灌胃14 d 大鼠糞便中游離型與酯型蝦青素含量比較

3 小結(jié)

中華管鞭蝦皂化和未皂化的蝦青素提取物在大鼠小腸內(nèi)吸收特性不同，灌胃12 h 后在大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中檢測(cè)到未皂化和皂化蝦青素，但是其蝦青素含量存在顯著性差異。經(jīng)過14 d 連續(xù)灌胃，通過比較大鼠新鮮糞便中蝦青素總量、游離型和酯型蝦青素分布及蝦青素含量，發(fā)現(xiàn)來源于中華管鞭蝦的皂化蝦青素提取物較未皂化蝦青素提取物具有更好的腸吸收性。因此，經(jīng)皂化的中華管鞭蝦的蝦青素提取物具有更廣的應(yīng)用前景。