不同產(chǎn)地連翹中主要活性成分含量的比較

胡金婉，原江鋒,2，王大紅,2，李佩艷，龔明貴

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 藥理科，江蘇 南京 210002)

0 引言

連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)為木犀科連翹屬落葉灌木，以野生為主。根據(jù)連翹果實成熟程度，商品中有青翹和老翹之分[1]。連翹在中國分布廣泛，根據(jù)連翹資源的歷史收購情況[2]，山西收購量約占總收購量的40%，河南約占30%，陜西約占20%，此外，湖北和安徽也是連翹資源的主產(chǎn)區(qū)。雖然同種藥材的遺傳特性具有相似性，然而由于地域和氣候等自然條件的差異，其化學成分的含量會有差異。中藥連翹因產(chǎn)地和采收時間的不同，其化學成分的含量也會有差異?！吨袊幍洹芬赃B翹苷和連翹酯苷A 的含量作為連翹質(zhì)量控制指標[3]，但是連翹中還含有苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮醇苷類和五環(huán)三萜類[4-5]等活性成分，連翹苷和連翹酯苷A 的含量并不能全面評價連翹的質(zhì)量。因此，測定連翹中高豐度的代表性活性成分的含量來全面評價連翹質(zhì)量具有重要意義。本試驗收集了連翹主產(chǎn)區(qū)的5省13批連翹藥材，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法，對樣品中的蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸等5種活性成分進行了含量測定，并對測定結(jié)果進行主成分分析和聚類分析，比較不同產(chǎn)地青翹和老翹中5種活性成分的綜合差異，旨在為連翹資源的綜合利用提供一定的科學依據(jù)。

1 試驗

1.1 儀器和試劑

儀器：1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HZK2064B型鼓風干燥箱(重慶漢瞻儀器有限公司)；BS-124S 型萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DL-5-B型粉碎機(上海安亭科學儀器廠)。

試劑：甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher 化學試劑公司)；蘆丁(批號100080-201408，質(zhì)量分數(shù)>98.5%)、連翹酯苷A(批號111810-201304，質(zhì)量分數(shù)>98.0%)、連翹苷(批號110821-201615，質(zhì)量分數(shù)>98.5%)、齊墩果酸(批號110709-201206，質(zhì)量分數(shù)>98.5%)和熊果酸(批號110742-201220，質(zhì)量分數(shù)>98.5%)均購于中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 材料

13批連翹藥材(編號為S1～S13)，2018 年收集于河南、山西、陜西、湖北和安徽，其中：S1和S3分別為河南盧氏和河南信陽青翹，S4、S5、S6、S7和S9分別為山西太原、山西長治、陜西太白、陜西洛南和陜西西安青翹，S10和S12分別為湖北武漢和安徽六安青翹，S2、S8、S11和S13分別為河南盧氏、陜西洛南、湖北武漢和安徽六安老翹。以上藥材經(jīng)河南科技大學農(nóng)學院侯小改教授鑒定為木犀科植物連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)的干燥果實。試驗材料在室溫下避光存放于干燥器中，使用前用粉碎機粉碎。

1.3 測定條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷流動相Ⅰ為乙腈(A)-水(B，含有質(zhì)量分數(shù)為0.2%的磷酸)，按照乙腈與水的體積比梯度洗脫，0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～20% A；10～20 min，20%～22% A；20～35 min，22%～50% A；36～46 min，95% A。體積流量1.0 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL；齊墩果酸和熊果酸流動相Ⅱ為V(甲醇)∶V(質(zhì)量分數(shù)1%的磷酸)=85∶15，流速0.6 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.4 混合對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷標準品，分別為10.0 mg、8.5 mg和9.5 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷質(zhì)量濃度分別為0.40 mg/mL、0.34 mg/mL和0.38 mg/mL 的混合對照品溶液Ⅰ。精密稱取齊墩果酸對照品13.5 mg，熊果酸對照品14.3 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，得到齊墩果酸和熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.54 mg/mL和0.57 mg/mL 的混合對照品溶液Ⅱ。

1.5 供試品溶液的制備

精密稱取青翹和老翹(S1～S13)粉末(過40目篩)2.00 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分數(shù)，下同)甲醇50 mL，密塞，稱量質(zhì)量，浸漬3 h，超聲(250 W，40 kHz)處理30 min，放冷，再稱量，用70%甲醇補足損失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。樣品平行處理3次。

2 結(jié)果分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液Ⅰ 0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL，用甲醇分別定容于10 mL容量瓶中；分別精密吸取混合對照品溶液Ⅱ 0.20 mL、0.40 mL、0.80mL、1.60 mL、3.20 mL和5.00 mL，用甲醇分別定容于10 mL容量瓶中。按1.3小節(jié)的色譜測定條件檢測，以對照品的峰面積為縱坐標(Y)，進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，得到線性回歸方程及線性范圍，見表1。

表1 線性回歸方程及線性范圍

2.1.2 精密度試驗

取編號為S3樣品粉末1份，按1.5小節(jié)的步驟制備供試品溶液，按1.3小節(jié)的色譜測定條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)。經(jīng)計算，5種活性成分峰面積的RSD為1.52%～1.89%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

取編號為S2樣品粉末1 份，按1.5小節(jié)的步驟制備供試品溶液，按1.3小節(jié)的色譜測定條件，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h進行檢測，記錄峰面積，計算RSD。經(jīng)計算，5種活性成分峰面積的RSD為1.37%～1.98%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復性試驗

取編號為S3粉末6份，按1.5小節(jié)的步驟制備供試品溶液，按1.3小節(jié)的色譜測定條件進樣， 記錄峰面積，并計算RSD。經(jīng)計算，5種活性成分峰面積的RSD為1.24%～1.86%，表明此方法重復性良好。

2.1.5 回收率試驗

精密稱定已知含量的同一連翹樣品1.00 g，平行6份，分別加入一定量的對照品溶液，制備供試品溶液，按1.3小節(jié)的色譜測定條件，計算回收率和RSD。經(jīng)計算，5種活性成分的回收率為97.6%～102.3%，RSD為1.15%～1.84%，表明所建立的方法準確度良好。

2.2 HPLC 圖譜分析

稱取連翹(S1～S13)粉末，按照1.5小節(jié)的方法制備供試品溶液，在1.3小節(jié)的色譜測定條件下進樣，記錄5種活性成分的保留時間和峰面積，用外標法分別計算蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。

13批不同產(chǎn)地連翹樣品的HPLC圖見圖1。混合流動相Ⅰ的連翹樣品色譜圖見圖1a，混合流動相Ⅱ的連翹樣品色譜圖見圖1b。由圖1可知：指標成分與其他成分的色譜峰分離良好，且與對照品保留時間一致。13批不同產(chǎn)地連翹中5種活性成分含量測定結(jié)果見表2。由表2可知：連翹中連翹酯苷A含量為2.77～48.20 mg/g，連翹苷含量為0.81～5.12 mg/g?！吨袊幍洹芬赃B翹酯苷A 和連翹苷的含量作為連翹質(zhì)量控制指標[3]，規(guī)定連翹藥材中連翹酯苷A 的含量不得低于2.50 mg/g，連翹苷含量不得低于1.50 mg/g，河南盧氏老翹(S2)中連翹苷的含量僅為0.81 mg/g，低于此質(zhì)量控制標準，也有文獻報道過河南盧氏老翹中連翹苷含量較低[6]，因此建議盧氏地區(qū)的連翹使用青翹入藥為宜。其余12批連翹中連翹苷和連翹酯苷A的含量均高于《中國藥典》規(guī)定的限量標準，這些地區(qū)的青翹和老翹均可入藥。蘆丁具有抗自由基、保護胃腸道黏膜等生物活性[7]；齊墩果酸具有抗病毒、消炎等功效[8-9]；熊果酸在保肝、降血糖等方面作用顯著[10-11]。由表2可知：連翹中蘆丁含量為1.47～5.74 mg/g，齊墩果酸含量為2.00～10.41 mg/g，熊果酸含量為2.96～14.50 mg/g，說明連翹除了具有連翹酯苷A和連翹苷的抗氧化、抑菌等生理活性外[12-13]，還具有蘆丁、齊墩果酸和熊果酸化合物的生理活性。

本試驗檢測的13批不同產(chǎn)地連翹中連翹酯苷A的含量明顯高于連翹苷，文獻[14]也發(fā)現(xiàn)連翹提取物中活性成分以連翹酯苷A為主。同一產(chǎn)地青翹中蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷的含量基本均高于老翹，這與文獻[15-16]所報道的結(jié)果趨勢相同。安徽六安青翹中齊墩果酸和熊果酸的含量高于老翹，但湖北武漢老翹中這兩種成分的含量高于青翹，說明齊墩果酸和熊果酸在青翹、老翹中的含量高低趨勢不固定。

(a) 流動相Ⅰ的樣品色譜圖

(b) 流動相Ⅱ的樣品色譜圖

圖1 不同產(chǎn)地連翹樣品的HPLC 圖

2.3 主成分分析

表3 成分矩陣

應用SPSS 25.0軟件，對13批不同產(chǎn)地連翹中5種活性成分的HPLC含量測定結(jié)果進行主成分分析。以初始特征值大于1為提取標準，總方差解釋結(jié)果顯示主成分1(principal component 1, PC1)和主成分2(principal component 2, PC2)的累積貢獻率達到80.68%，表明前兩個主成分代表了樣品組分的大部分信息，可用這兩個主成分對連翹藥材進行綜合評價，成分矩陣結(jié)果見表3。由表3可知：對PC1貢獻較大的是蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷，對PC2貢獻較大的是齊墩果酸和熊果酸。根據(jù)兩個主成分(PC1、PC2)得分，以各主成分的方差貢獻率作為權(quán)重，進行線性加權(quán)，構(gòu)建連翹質(zhì)量評價函數(shù)，得出不同產(chǎn)地連翹的綜合得分值，見表4，分值越高表示品質(zhì)相對越好[17]。由表4可知：河南信陽青翹(S3)和安徽六安青翹(S12)的綜合評價較好，而河南盧氏老翹(S2)的綜合評價相對較差。

表4 不同產(chǎn)地連翹的綜合得分值

2.4 聚類分析

聚類分析是將相似度大的樣品優(yōu)先聚合，最終按照類別的綜合性質(zhì)完成多個品種聚合的過程[18]。為了考察連翹中5種活性成分含量差異與產(chǎn)地、青老翹采摘時間之間的相互關系，以13批不同產(chǎn)地連翹中5種活性成分的含量為基準進行聚類分析，采用離差平方和法，以平方歐氏距離作為樣品相似性的

圖2 13批連翹樣品聚類分析圖

測度[19]，分析結(jié)果見圖2。選擇閾值為25，則13批不同產(chǎn)地連翹樣品可分為4個大類：第1類，河南盧氏青翹(S1)、陜西太白青翹(S6)、陜西洛南青翹(S7)、陜西西安青翹(S9)，這4個批次連翹中蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷含量相當，聚為一類；第2類，河南盧氏老翹(S2)、陜西洛南老翹(S8)、湖北武漢青翹(S10)、湖北武漢老翹(S11)，這4個批次連翹中熊果酸含量較高，聚為一類；第3類，河南信陽青翹(S3)、安徽六安青翹(S12)，這2個批次連翹中蘆丁、連翹酯苷A和連翹苷的含量較高，聚為一類；第4類，山西太原青翹(S4)、山西長治青翹(S5)、安徽六安老翹(S13)，這3個批次連翹中齊墩果酸和熊果酸含量接近，聚為一類。第3類中S3、S12聚成一類，這兩個樣品在主成分分析中綜合得分排序分別為第1位和第2位，表明聚類結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。聚類結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，除安徽六安老翹(S13)外，基本按地域性聚成4類，S1、S6、S7和S9屬于同一造山系的秦嶺山脈和伏牛山脈的青翹聚成一類，熊果酸含量較高的湖北武漢、陜西洛南和河南盧氏的老翹聚成一類，河南信陽和安徽六安同屬于大別山脈的青翹聚為一類，而山西太原和山西長治的青翹聚成一類，該分類符合地域分布特征。除了湖北武漢青翹和安徽六安老翹，聚類分析能夠區(qū)分樣品中的青翹和老翹。

3 結(jié)論

(1)建立了不同產(chǎn)地連翹的HPLC指紋圖譜，在色譜條件下測定結(jié)果顯示5種活性成分的線性關系良好(r=0.999 3～0.999 7)；穩(wěn)定性和重復性的RSD均小于2%；回收率為97.6%～102.3%，RSD為1.15%～1.84%。

(2)河南信陽青翹中的蘆丁、連翹酯苷A 和連翹苷的含量均為最高，同一產(chǎn)地青翹中這3 種活性成分的含量高于老翹，從活性成分的含量來看，建議采摘青翹入藥。

(3)主成分分析以5 種主要活性成分含量為基礎構(gòu)建了連翹的質(zhì)量評價函數(shù)，能夠直觀評價不同產(chǎn)地連翹藥材的差異性，綜合質(zhì)量評價排序結(jié)果顯示河南信陽青翹排在第1位，安徽六安青翹排在第2位，表明這兩個產(chǎn)地青翹的綜合質(zhì)量評價相對較好。

(4)聚類分析將13批不同產(chǎn)地連翹分為4大類，主要是根據(jù)連翹的產(chǎn)地和青老翹采摘時間進行分類。除了安徽六安老翹，同屬于秦嶺和伏牛山脈的河南和陜西主產(chǎn)區(qū)的青翹和老翹各聚為一類，同屬于大別山脈的河南信陽和安徽六安的青翹聚為一類，而山西太原和山西長治的青翹聚成一類。聚類分析結(jié)果對于連翹資源的綜合利用具有一定的指導意義。