山東雞爪綿核桃花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察

唐貴敏，劉丙花，舒秀閣，梁 靜，趙登超*，侯立群*

（1.山東英才學(xué)院，山東濟(jì)南251400； 2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014）

山東省是我國核桃東部沿海分布區(qū)的主要產(chǎn)區(qū)之一，濟(jì)南市南部山區(qū)是山東核桃主產(chǎn)區(qū)之一，其核桃栽培歷史已有2 000 多年。目前在濟(jì)南市歷城區(qū)南部山區(qū)高爾鎮(zhèn)、柳埠鎮(zhèn)、仲宮鎮(zhèn)、西營鎮(zhèn)等地均保存大量的百年大樹[1]，該地區(qū)典型的核桃品種資源為雞爪綿核桃，其經(jīng)歷歷代果農(nóng)長期實(shí)生繁殖，座果率高，因結(jié)果枝形似雞爪而得名。堅(jiān)果品質(zhì)優(yōu)良，生長勢、抗逆性強(qiáng)，在泰山山脈丘陵山地區(qū)大面積栽培，在農(nóng)民增收致富、美麗鄉(xiāng)村建設(shè)和鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興中發(fā)揮了十分重要的作用。

花粉在植物的花粉囊中發(fā)育而成，其生長發(fā)育環(huán)境相對封閉，受外界環(huán)境影響小，為此其形態(tài)特征具有很強(qiáng)的遺傳性，是研究植物物種演化和分類的重要依據(jù)[2]。國內(nèi)外的許多學(xué)者對棗、油茶、櫻桃、蘋果等樹種的花粉形態(tài)進(jìn)行了觀察，為其品種的分類鑒定、親緣關(guān)系及其起源演化等提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持[3～5]。在核桃屬植物研究方面，有對核桃科不同樹種[6]、薄殼山核桃[7～8]和新疆早實(shí)核桃[9]花粉顯微結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)報(bào)道，其研究結(jié)果為核桃或薄殼山核桃品種（系）的分類和鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。目前，關(guān)于晚實(shí)核桃的花粉形態(tài)學(xué)研究較少，為此本文選取山東省南部山區(qū)特色地方品種‘雞爪綿’核桃為試驗(yàn)材料，同時(shí)與早實(shí)核桃品種（系）進(jìn)行對比分析，通過掃描電鏡觀測對比分析其花粉粒形態(tài)結(jié)構(gòu)，分析其差異特征，旨在為山東省‘雞爪綿’核桃種質(zhì)資源的鑒定及分類提供孢粉學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的核桃花粉來源于山東省濟(jì)南市南部山區(qū)典型的雞爪綿核桃優(yōu)株和早實(shí)核桃品種（系）共5 份，其中雞爪綿核桃為3 個優(yōu)良株系（編號：GW1、GW2、GW3）、新疆早實(shí)核桃株系1 個（編號：XW1）和核桃品種‘綠香’。

1.2 試驗(yàn)方法

2020年3月—4月，于核桃雄花盛花期時(shí)采集帶雄花核桃枝條，帶回試驗(yàn)室后，將核桃枝條于水中進(jìn)行培養(yǎng)，放置于硫酸紙上，待雄花序自然散粉后，收集花藥，用pH=6.8 的戊二醛固定，并置于4℃冰箱保存、備用。

1.3 電子掃描顯微鏡觀察

將樣品從戊二醛固定液中取出，用0.1 M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）進(jìn)行充分漂洗，1%的鋨酸·0.1M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）室溫（20℃）固定1～2 h，0.1 M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）再次漂洗，梯度乙醇進(jìn)行脫水，脫水后放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥，于導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上進(jìn)行噴金處理，使用SU3800 掃描電鏡分別觀察不同核桃花粉的形狀、赤道面觀和極面觀特點(diǎn)以及萌發(fā)孔、外壁紋飾特點(diǎn)，并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.4.1 花粉粒

隨機(jī)選取20 粒花粉，進(jìn)行測定分析，分析軟件：Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville,MD, USA)。測量方法：應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件以2.5K 20um 標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，每個樣品共選取多個完整清晰的視野，分別測量其極軸長（μm）及赤道軸長（μm)（見圖1），并計(jì)算極軸長與赤道軸長的比值（P/E，表示花粉形狀），極軸長與赤道軸長的乘積(P×E，表示花粉的大小)[6]。結(jié)合電鏡顯微標(biāo)尺長度計(jì)算其實(shí)際長度，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 核桃花粉掃描電鏡觀測

根據(jù)王開發(fā)等人[10]對花粉形狀類型的劃分標(biāo)準(zhǔn)（見表1），對不同核桃花粉粒的形狀進(jìn)行分類。

表1 花粉形狀的分類標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Classification criteria of pollen shape

2 結(jié)果與分析

核桃花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察結(jié)果（見圖2圖版A～E）所示，通過觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中雞爪綿核桃和早實(shí)核桃花粉外觀形態(tài)相似，花粉粒均以單粒的形式存在；核桃花粉表面均勻分布著顆粒狀雕紋，且較為密集，萌發(fā)孔凸出于花粉表面。

圖2 不同類型核桃花粉形態(tài)的掃面電鏡觀察結(jié)果Figure 2 Observation result of pollen morphology of different Walnuts by SEM

供試材料中，雞爪綿核桃花粉的極軸長 （P）為31.15～32.73 μm，赤道軸長（E）為23.22～25.65 μm；‘綠香’核桃極軸長為32.05 μm，赤道軸長為26.47 μm；新疆早實(shí)核桃極軸長較小為30.35 μm，赤道軸長為24.30 μm，雞爪綿核桃的花粉大小為760.19～801.19 μm2，新疆早實(shí)核桃為737.31 μm2，‘綠香’核桃最大為849.33 μm2，表2和表3方差分析結(jié)果表明，雞爪綿核桃花粉與新疆早實(shí)、‘綠香’核桃的極軸、赤道軸和花粉粒大小無顯著差異。

表2 不同類型核桃花粉特征值比較Table 2 Comparisons of the values of pollen morphological characteristics between different walnuts

表3 不同類型核桃花粉形態(tài)特征值的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of the values of pollen morphological characteristics of different walnuts

根據(jù)極軸/赤道軸(P/E)值確定不同核桃類型花粉粒的形狀，試驗(yàn)材料中花粉(P/E)值在1.22～1.41 之間，依據(jù)王開發(fā)等人[10]對花粉形狀類型的劃分標(biāo)準(zhǔn)，確定試驗(yàn)材料中花粉形狀類型均屬于長球形。

3 討論與結(jié)論

雞爪綿核桃作為山東省特色地方品種，屬于晚實(shí)核桃品種類型（嫁接后第4—5年開始結(jié)果）、抗?。ê诎卟?、炭疽病）性強(qiáng)，而新疆核桃表現(xiàn)為早實(shí)（嫁接后第2—3年開始結(jié)果）、豐產(chǎn)、易感病等特性，兩個核桃類型在我國核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展中均做出突出的貢獻(xiàn)。毛霞等[6]觀察了核桃科植物的花粉，并根據(jù)花粉粒的大小對不同的進(jìn)化進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)普通核桃花粉為單粒花粉，屬于中等演化水平。劉壯壯等[7]研究不同薄殼山核桃品種花粉形態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同無性系間體積差異表現(xiàn)顯著，花粉粒形狀均為扁球形，花粉表面呈顆粒狀紋飾，均勻分布著顆粒狀的突起，無性系間表面紋飾差異不明顯。本試驗(yàn)中雞爪綿核桃和新疆核桃花粉同是單?；ǚ?，方差分析結(jié)果顯示雞爪綿核桃間，并與早實(shí)核桃進(jìn)行對比分析，其花粉大小差異不顯著，且2 個類型核桃表面紋飾均為密集分布的顆粒狀并分布在整個花粉表面，說明其的演化水平相當(dāng)。

寧萬軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)新疆早實(shí)核桃‘新新2 號’花粉粒性狀為扁球形，其余為近球形，花粉極軸長度在33.55～41.68 μm，赤道軸長度在37.87～43.46 μm，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞爪綿核桃花粉的極軸長為31.15～32.73 μm，赤道軸長為23.22～25.65 μm；‘綠香’核桃極軸長為32.05 μm，赤道軸長為26.47 μm；新疆早實(shí)核桃單株極軸長較小為30.35 μm，赤道軸長為24.30 μm，其花粉形狀均為長球形。對比寧萬軍的研究結(jié)果，新疆早實(shí)核桃在山東省栽培種植后，其花粉表現(xiàn)變小，可能是與品種（系）不同有關(guān)，但張延龍等[11]認(rèn)為花粉粒大小可能與植物生長環(huán)境有關(guān)系，其花粉粒大小變化也可能是山東南部山區(qū)的氣候條件和新疆地區(qū)的環(huán)境條件差異有關(guān)系，下一步可以通過對比分析同一品種的生長表現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證說明。