基于疼痛抑制行為測試的青藤堿鎮(zhèn)痛作用*

蘇 漫 ，衛(wèi)蒨蒨，歐云淘，周致用，唐文婷，錢珣佳，朱 清***，李俊旭

(1 南通大學藥學院，南通 226001；2 湖北省武漢市紅十字會醫(yī)院藥劑科)

疼痛尤其是慢性疼痛嚴重困擾著人類健康，給個人和社會都帶來沉重的負擔。目前臨床上使用的鎮(zhèn)痛藥物，如傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和阿片類鎮(zhèn)痛藥，常因療效有限性及毒副作用導致在臨床的應用受到限制[1]。目前用于治療慢性疼痛患者的藥物處于嚴重不足的狀態(tài)[2]，因此對于治療慢性疼痛的藥物研發(fā)具有較高的臨床需求。

目前在鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)上仍然沒有實質性的突破[3]。有些學者[4]認為新型鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的臨床轉化效率低下，在一定程度上是因為現(xiàn)有的疼痛動物模型不能很好地表現(xiàn)出臨床疼痛的癥狀。傳統(tǒng)的動物模型，疼痛測量指標主要以甩尾，縮足、舔足，扭體等疼痛激發(fā)行為為主。這些行為在受到傷害性刺激后被激發(fā)，而在正常情況下發(fā)生頻率很低或者不發(fā)生。這種測量方法往往無法區(qū)分藥物的運動干擾效應和真實的鎮(zhèn)痛效應[5]。近年來有學者[6]建議使用疼痛抑制行為來作為疼痛測量指標，即測量動物的一些固有行為，如攝食、自主活動、筑巢等，在受到傷害刺激后被抑制，導致頻率降低而非增加。由于真正的鎮(zhèn)痛作用可以改善疼痛引發(fā)的抑制行為，而運動功能損傷則無此效應。所以將疼痛抑制行為測量方法用于鎮(zhèn)痛藥效評價可以甄別真正的鎮(zhèn)痛作用和運動損傷的干擾效應。另外臨床上對疼痛的評價，很大程度上依賴于疼痛抑制行為的測試。因此，動物疼痛抑制行為測試有助于加快鎮(zhèn)痛候選藥物從臨床前向臨床的轉化進程[7]。綜上所述，基于疼痛抑制行為的測量方法，與傳統(tǒng)疼痛激發(fā)行為測試互為補充，用于藥物鎮(zhèn)痛效應的評價能大大提高鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的預測效度。

青藤堿是來源于防己科植物青風藤的一種生物堿，結構與嗎啡類似，具有抗炎、抗風濕、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、降血壓及抗心律失常等多種藥理作用[8]，臨床上已有成品用于治療風濕性關節(jié)炎等疾病。近年來，國內外學者[9-11]研究發(fā)現(xiàn)青藤堿對多種動物疼痛模型具有廣泛的鎮(zhèn)痛效應。本課題組前期研究[12-13]結果也發(fā)現(xiàn)青藤堿對大鼠神經(jīng)病理性疼痛及切口手術后疼痛模型具有明顯的鎮(zhèn)痛效應。但是之前的研究均從疼痛激發(fā)行為的角度來觀察青藤堿的鎮(zhèn)痛效應，而青藤堿對于疼痛抑制行為是否有效目前尚不清楚，有可能導致臨床上出現(xiàn)假陽性。本研究通過建立疼痛抑制行為的測試方法，觀察青藤堿對疼痛抑制行為的改善作用，這將為青藤堿作為鎮(zhèn)痛藥物應用于臨床提供更確切可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性ICR 小鼠，體質量20～25 g，由南通大學實驗動物中心提供。實驗室溫度(22±1)℃，濕度50%～70%，12 h 光照(7:00—19:00)，實驗前適應環(huán)境至少3 d，實驗期間小鼠自由飲食、飲水。

1.2 藥物與試劑 青藤堿與酮洛芬購于上海阿拉丁試劑公司；青藤堿用生理鹽水配制，酮洛芬用1%Tween-80 溶解配制。乳酸購于北京百靈威科技有限公司，用生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.3 乳酸扭體實驗[14]每只小鼠腹腔注射不同濃度乳酸后，單獨放置在透明的樹脂觀察箱中，觀察20 min 內小鼠的扭體次數(shù)。扭體反應定義為小鼠腹部收縮內凹、身體與后肢伸張、臀部翹起及蠕行，作為疼痛激發(fā)行為來量化乳酸誘發(fā)的疼痛。

1.4 自主活動測試[15]小鼠的自主活動通過YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(濟南延益科技有限公司,中國)記錄，將小鼠放進黑色塑料暗箱內，光傳感器位于暗箱內，記錄小鼠30 min 內自主活動次數(shù)。

1.5 筑巢實驗[16]實驗前，每只小鼠單獨飼養(yǎng)在飼養(yǎng)籠(320 mm×215 mm×170 mm)中，每只塑料籠中均勻放置6 個棉球適應2 d。實驗中，將小鼠籠從飼養(yǎng)室轉移到無窗實驗室，500 流明光照，適應10 min，給予相應的藥物處理后，立即將小鼠放回籠中，均勻放入新的棉球進行實驗，觀察并記錄90 min 內小鼠的筑巢情況(即清除棉球的個數(shù))。實驗期間小鼠自主進食和飲水。

1.6 實驗設計

1.6.1 青藤堿對乳酸扭體疼痛行為的影響 (1)乳酸扭體疼痛模型建立：小鼠分別腹腔注射生理鹽水和3 個不同濃度(0.1%,0.18%,0.32%)乳酸(給藥體積10 mL/kg)，觀察并記錄20 min 內的扭體次數(shù)。然后在最佳的乳酸濃度條件下，于不同的預處理時間(0,10,30 min)記錄小鼠扭體次數(shù)。(2)青藤堿對小鼠乳酸扭體的鎮(zhèn)痛作用：根據(jù)前期研究結果[13]選擇青藤堿有效劑量30 mg/kg。皮下注射后經(jīng)不同預處理時間(5,30,60,90,180,270 min) 后腹腔注射乳酸造模，觀察其扭體反應。設一組為賦型劑組，即予生理鹽水后乳酸造模。確定青藤堿最佳預處理時間后，研究青藤堿對乳酸扭體疼痛模型作用的劑量依賴性。于最佳預處理時間皮下注射青藤堿不同劑量(1,3,10,20,30 mg/kg)，然后給予乳酸后記錄小鼠扭體次數(shù)。同時使用酮洛芬作為陽性對照藥，給予4 個劑量(1,3,10,30 mg/kg)酮洛芬皮下注射，30 min 后予乳酸，記錄小鼠扭體次數(shù)，比較青藤堿與酮洛芬的作用。

1.6.2 青藤堿對乳酸誘導的小鼠自主活動抑制的影響 (1)乳酸誘導的自主活動抑制模型建立：腹腔注射0.32%乳酸，經(jīng)不同的預處理時間(0,30,60 min)后自主活動計數(shù)，選擇最佳預處理時間。分別給予小鼠腹腔注射0.1%、0.18%、0.32%乳酸，經(jīng)最佳預處理時間后自主活動次數(shù)，選擇最佳乳酸濃度。(2)青藤堿對乳酸誘導小鼠自主活動抑制的影響：青藤堿不同劑量(3,10,20,30 mg/kg)預處理30 min 后，給予乳酸處理記錄小鼠活動次數(shù)。在確定青藤堿最佳作用劑量后，研究青藤堿不同預處理時間(5,30,60,90,150,270 min)對0.32%乳酸所導致的自主活動抑制行為的影響。同時觀察不同劑量(1,3,10,30 mg/kg)酮洛芬皮下注射30 min 后，給予乳酸小鼠30 min內的活動次數(shù)，比較青藤堿與酮洛芬對乳酸誘導小鼠自主活動抑制的影響。(3)青藤堿對正常小鼠自主活動的影響：小鼠分別給予生理鹽水(賦形劑組)以及不同劑量(3,10,30 mg/kg)青藤堿預處理30 min 后，自主活動計數(shù)。

1.6.3 青藤堿對乳酸誘導的小鼠筑巢抑制的影響(1)乳酸誘導的小鼠筑巢抑制模型建立：腹腔注射0.32%乳酸不同的預處理時間(5,30,60,120 min)后記錄其90 min 內筑巢情況，選擇最佳預處理時間。小鼠分別腹腔注射0.1%、0.18%、0.32%乳酸，經(jīng)最佳預處理時間后記錄筑巢情況，選擇最佳乳酸濃度。(2)青藤堿對乳酸誘導的小鼠筑巢行為抑制的影響：青藤堿不同劑量(3,10,20,30 mg/kg)預處理30 min 后，給予乳酸處理后記錄小鼠筑巢情況。在確定青藤堿最佳作用劑量后，研究不同預處理時間(0,30,60,90 min)對乳酸導致筑巢抑制的影響。同樣觀察陽性對照藥酮洛芬不同劑量(1,3,10,30 mg/kg)皮下注射30 min后，給予乳酸后記錄小鼠筑巢情況，比較青藤堿與酮洛芬對乳酸誘導小鼠筑巢活動抑制的影響。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示，用GraphPad Prism 5.01(San Diego,CA,USA)進行統(tǒng)計分析和繪圖。組內時間和治療劑量的比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間多重比較采用Bonferroni post hoc 分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 青藤堿對乳酸扭體疼痛行為的影響 生理鹽水對照組小鼠扭體次數(shù)為0，僅0.32%乳酸引起扭體次數(shù)較對照組顯著增加(P<0.001)(圖1A)。0.32%乳酸在0 min 和10 min 預處理時間的扭體次數(shù)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)，而30 min預處理時間引起的扭體反應次數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1B)。因此，選擇0.32%乳酸預處理0 min 建立乳酸扭體疼痛模型。

在此基礎上，首先觀察青藤堿30 mg/kg 不同預處理時間對乳酸誘導扭體反應的影響，結果顯示青藤堿預處理5 min 即起效，30 min 為最佳效應時間，至60 min 時，青藤堿鎮(zhèn)痛作用消失(圖1C)。然后選擇預處理時間為30 min，觀察不同劑量青藤堿對0.32%乳酸誘導的扭體反應的影響，結果顯示10～30 mg/kg 的青藤堿均顯著改善乳酸引起的疼痛扭體反應(P<0.05)，且這一作用呈劑量依耐性(圖1D)。同時陽性對照藥酮洛芬1～30 mg/kg 對0.32%乳酸引起的扭體反應均有顯著抑制作用(P<0.001)(圖1E)。

圖1 青藤堿對乳酸扭體的鎮(zhèn)痛作用

2.2 青藤堿對乳酸誘導的小鼠自主活動抑制的影響 0.32%乳酸在不同的預處理時間對小鼠自主活動的影響結果見圖2A，預處理0、30、60 min 測定的自主活動與對照組相比均顯著降低(P<0.05)；不同濃度的乳酸0 min 處理后的小鼠自主活動檢測結果見圖2B，僅0.32%乳酸顯著降低小鼠自主活動(P<0.01)。因此，選擇0.32%乳酸預處理0 min 誘導小鼠自主活動行為抑制模型。

根據(jù)前述結果，以青藤堿對乳酸扭體最佳作用時間30 min 作為預處理時間，觀察不同劑量的青藤堿對乳酸誘發(fā)自主活動抑制的改善作用。結果顯示只有3 mg/kg 的青藤堿與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2C)，表現(xiàn)出明顯的改善作用。圖2D 顯示3 mg/kg 的青藤堿預處理30～90 min 對乳酸誘導小鼠自主活動抑制均具有一定的改善作用(P<0.05)，而預處理30 min 時的作用最顯著(P<0.01)，且隨著預處理時間的延長改善作用逐漸減弱。同時陽性對照藥酮洛芬(1～10 mg/kg)對0.32%乳酸引起的自主活動抑制均有改善作用(P<0.001)，而30 mg/kg酮洛芬改善作用不明顯(圖2E)。

此外，還觀察了青藤堿對正常小鼠的自主活動，結果顯示青藤堿3～30 mg/kg 與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2F)，說明所使用劑量的 青藤堿對正常小鼠自主活動無影響。

圖2 青藤堿對乳酸誘導的小鼠自主活動抑制的影響

2.3 青藤堿對乳酸誘導的小鼠筑巢行為抑制的影響 0.32%乳酸不同的預處理時間對小鼠筑巢行為的影響結果見圖3A，結果顯示0.32%乳酸預處理5、30、60 min，筑巢行為與對照組相比均顯著降低(P<0.001)，其中預處理時間5 min 抑制情況最明顯。而不同濃度的乳酸預處理5 min 后的筑巢行為檢測結果見圖3B，結果顯示乳酸呈濃度依賴性地抑制小鼠的筑巢行為。與對照組比較，0.18%(P<0.01)和0.32%乳酸(P<0.001)均顯著減少小鼠的筑巢行為，尤其是0.32%乳酸最為顯著，而0.1%雖有降低趨勢但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此，選擇0.32%乳酸預處理5 min誘發(fā)筑巢行為抑制模型。

在此基礎上，觀察不同劑量(3,10,20,30 mg/kg)青藤堿預處理30 min 對0.32%乳酸誘發(fā)的筑巢行為抑制的影響(圖3C)。20～30 mg/kg 青藤堿均顯著改善乳酸誘發(fā)的筑巢行為抑制(P<0.05)，其中20 mg/kg的改善作用最顯著(P<0.001)；然后觀察20 mg/kg 青藤堿在預處理0、30、60、90 min 時對乳酸誘發(fā)的筑巢行為抑制的改善作用，結果發(fā)現(xiàn)預處理30 min 時作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖3D)。同時觀察陽性對照藥酮洛芬(1～30 mg/kg)對0.32%乳酸引起的筑巢抑制的影響，結果發(fā)現(xiàn)只有3 mg/kg 酮洛芬能改善筑巢的抑制(P<0.05)(圖3E)。

圖3 青藤堿對乳酸誘導筑巢行為抑制的影響

2.4 青藤堿與酮洛芬對乳酸疼痛模型鎮(zhèn)痛作用比較 將青藤堿與酮洛芬對乳酸模型疼痛激發(fā)行為(扭體)以及抑制行為(自主活動與筑巢)的作用進行比較，結果如表1 所示。青藤堿對扭體的抑制率均顯著低于酮洛芬，這說明青藤堿在減輕疼痛激發(fā)行為方面要低于酮洛芬的鎮(zhèn)痛效應。青藤堿對自主活動的改善率亦顯著低于酮洛芬，表明青藤堿對疼痛引起的自主活動抑制的改善作用要低于酮洛芬。筑巢恢復率對比結果顯示，在3、10、30 mg/kg 時青藤堿無顯著改善作用，在20 mg/kg 時對筑巢的恢復率為64.1%，而酮洛芬在1、10、30 mg/kg 無顯著改善作用，在3 mg/kg 時筑巢恢復率為49.2%。這說明青藤堿對疼痛引起的筑巢抑制的恢復作用要優(yōu)于酮洛芬。

表1 青藤堿與酮洛芬對乳酸模型疼痛激發(fā)行為以及抑制行為的作用比較%

3 討 論

目前，疼痛抑制行為測試用于動物疼痛模型研究受到越來越多的關注和認可，如利用各種疼痛模型誘發(fā)攝食[17]、自主活動[18]、糖精偏愛[19]、輪跑運動[20-21]、挖掘[22-24]以及筑巢等行為[14,16]的抑制作為疼痛的判斷指標，并運用于藥效的評價。有學者[25]認為，這些疼痛抑制行為的測試可能會成為臨床前疼痛研究實驗室的標準方法。本研究首先建立疼痛抑制行為的測試方法作為疼痛評價的指標，參考文獻[14,16]選擇乳酸腹腔注射導致內臟痛模型來誘發(fā)扭體反應(疼痛激發(fā)行為)和自主活動及筑巢行為的抑制(疼痛抑制行為)。在乳酸扭體模型建立的過程中，發(fā)現(xiàn)只有0.32%的乳酸且預處理時間為0 min 時(即給予乳酸后立即觀察)顯著性激發(fā)扭體行為，一旦≥30 min則扭體反應幾乎消失，說明疼痛激發(fā)行為維持時間較短。同時，觀察了乳酸腹腔注射對小鼠自主活動以及筑巢行為的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸呈劑量依賴性抑制小鼠自主活動和筑巢行為，尤其0.32%乳酸作用最為顯著，且在預處理時間60 min 時差異仍有統(tǒng)計學意義，說明疼痛抑制行為維持時間較長，和文獻[16,19]結果類似。

在疼痛激發(fā)行為研究中，青藤堿(10～30 mg/kg)能劑量依賴性地減少乳酸所致的小鼠扭體次數(shù)，說明對酸注射內臟痛有良好的鎮(zhèn)痛作用。在疼痛抑制行為研究中，青藤堿能有效改善乳酸誘導的自主活動以及筑巢行為的抑制，其最佳作用時間與改善扭體行為的最佳作用時間一致(30 min)。由于青藤堿在所用劑量范圍(3～30 mg/kg)對正常小鼠自主活動并無明顯影響，說明青藤堿對激發(fā)行為及抑制行為的改善并不是通過干擾小鼠的運動功能，而是由于對疼痛水平的改善，即產生確切的鎮(zhèn)痛來發(fā)揮作用的。本研究發(fā)現(xiàn)青藤堿對不同抑制行為作用的最佳劑量不一致，即青藤堿改善自主活動的最佳劑量為3 mg/kg，而改善筑巢行為的最佳劑量為20 mg/kg。推測這是由于誘發(fā)不同抑制行為所需的疼痛水平是不同的。對于自主活動實驗，只有0.32%的乳酸才會引起明顯自主活動抑制，說明疼痛比較顯著時才會抑制自主活動，輕中度疼痛水平對自主活動影響并不顯著。而3 mg/kg 青藤堿能適當減少扭體反應(雖未達到統(tǒng)計學差異)，稍微緩解其疼痛水平即可改善自主活動的抑制。青藤堿具有一定鎮(zhèn)靜作用[8]，本實驗觀察到青藤堿在3～30 mg/kg 雖無明顯鎮(zhèn)靜作用，但呈現(xiàn)出降低自主活動的趨勢。本課題組[12]也發(fā)現(xiàn)青藤堿在高劑量(80 mg/kg)時出現(xiàn)鎮(zhèn)靜作用。所以推測當青藤堿加大劑量時，其對自主活動微弱的抑制作用會抵消其因緩解疼痛而對自主活動抑制的改善作用，故青藤堿在10～30 mg/kg 時改善作用反而下降。而對于筑巢行為實驗，0.18%～0.32%的乳酸均會引起明顯筑巢行為抑制，說明在較低疼痛水平就會抑制筑巢活動，所以較大劑量(20～30 mg/kg)青藤堿明顯緩解疼痛，才能改善筑巢行為。但加大青藤堿劑量會對運動功能有微弱抑制作用，所以青藤堿30 mg/kg 對筑巢改善作用反而低于20 mg/kg。同時，筑巢行為實驗受環(huán)境因素影響較大，不同批次的動物實驗可能因不同時間、溫度、噪音及光暗環(huán)境下結果略有差異。所以每次觀察藥物療效時，都要以同一批次實驗的動物造模作為陰性對照。本研究還發(fā)現(xiàn)陽性對照藥酮洛芬對乳酸誘發(fā)的疼痛激發(fā)行為以及抑制行為均有改善作用，與文獻[16]結果一致；將其作用和青藤堿進行比較，結果發(fā)現(xiàn)青藤堿在減輕疼痛激發(fā)行為以及改善自主活動抑制方面要弱于酮洛芬，但對疼痛引起的筑巢抑制的恢復作用要優(yōu)于酮洛芬。

綜上所述，本研究成功建立乳酸誘發(fā)的疼痛抑制行為的測試方法，通過從疼痛抑制行為角度研究青藤堿的鎮(zhèn)痛作用，發(fā)現(xiàn)青藤堿在顯著抑制疼痛的激發(fā)行為同時，還能有效改善疼痛的抑制行為，這更加確證了青藤堿的鎮(zhèn)痛作用，為青藤堿作為鎮(zhèn)痛藥物應用于臨床提供了可靠的依據(jù)。