地楓皮組織培養(yǎng)獲得再生植株的研究

李小泉等

摘要：采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)培養(yǎng)地楓皮種苗，為人工栽培提供優(yōu)良地楓皮種苗。以地楓皮的莖段、頂芽作為外植體，用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得叢生芽，進(jìn)而生根獲得再生植株。結(jié)果表明，地楓皮初代誘導(dǎo)較好的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA較有利于叢生芽繼代增殖，增殖系數(shù)為3.2；培養(yǎng)基1/2MS+1.0 mg/L IAA較適宜誘導(dǎo)地楓皮無(wú)菌芽的生根；在適宜的基質(zhì)上移栽，地楓皮種苗成活率為70%。得出的方法具有不受季節(jié)和地點(diǎn)限制、繁殖系數(shù)較高等優(yōu)點(diǎn)，隨著研究不斷深入，技術(shù)不斷完善，將為地楓皮種苗繁育提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：地楓皮；組織培養(yǎng)；叢生芽；生根

中圖分類號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0087-03

收稿日期：2015-03-09

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：桂科合14125008-2-21）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題（編號(hào)：重2012115、重200908）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)（編號(hào)：GZBZ14-14）；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2011GXNSFD018037）。

作者簡(jiǎn)介：李小泉（1968—），男，廣西全州人，碩士，副研究員，從事植物組織培養(yǎng)研究。E-mail：1941243276@qq.com。

通信作者：李林軒，助理研究員，從事中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。地楓（Illicium difengpi K.I.B.et K.I.M.）別稱鉆地風(fēng)、追地風(fēng)、山八角，地楓皮為其干燥樹(shù)皮，為木蘭科八角屬珍稀瀕危藥用植物[1]。地楓皮主要分布于廣西靖西、天峨、都安、馬山、龍州等縣的巖溶石山山頂，為廣西的特有中藥材[2-3]，其莖皮、根皮具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛等功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、氣滯腹痛、婦人經(jīng)期腹痛等癥狀，治療效果好，藥用價(jià)值高，為多種中成藥的主要原材料[4]。地楓皮生境分布范圍狹窄，生長(zhǎng)緩慢，且藥用部位為莖皮與根皮，因此采收后植株也無(wú)法成活。目前地楓皮藥用資源來(lái)源于野生自然資源，由于地楓皮種子皮較薄，干燥時(shí)種子的油脂會(huì)變質(zhì)，過(guò)濕時(shí)又容易腐爛，極易喪失發(fā)芽能力，加上其生長(zhǎng)所需的石灰?guī)r土壤稀少，無(wú)法為地楓皮種子的萌芽提供適宜的環(huán)境，造成地楓皮繁殖能力弱。隨著地楓皮藥用需求量不斷增加，野生自然資源不斷減少，在很多地區(qū)瀕臨滅絕或已絕跡，1999年地楓皮被批準(zhǔn)為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1]。目前對(duì)地楓皮的研究主要集中在資源調(diào)查[3]、真?zhèn)舞b別[5]、分子標(biāo)記[6]、化學(xué)成分[7]、藥理作用[8]等方面，在種苗培育方面還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)對(duì)地楓皮進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以期為地楓皮人工栽培提供大量?jī)?yōu)良種苗，對(duì)于保護(hù)地楓皮野生種質(zhì)資源和維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)多樣性具有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

采集廣西藥用植物園大棚內(nèi)盆栽的地楓皮，剪取健壯無(wú)病蟲(chóng)害植株的莖段、頂芽為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體滅菌及培養(yǎng)條件將地楓皮莖段、頂芽用洗潔精水浸泡10 min，用清水沖洗15 min，濾干水后在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇浸泡30 s，用無(wú)菌水清洗1次；在0.1%HgCl2溶液中浸泡5～12 min，用無(wú)菌水沖洗3次，每次浸洗3 min，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度（25±3） ℃、光照時(shí)間12 h/d、光照度1 500～2 000 lx。培養(yǎng)基中含2%蔗糖、5%瓊脂，pH值5.8～62。

1.2.2初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選初代誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A1處理）、1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A2處理）、1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A3處理）、2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A4處理）。最佳基本培養(yǎng)基的篩選：將誘導(dǎo)得到的無(wú)菌芽分別接入上述試驗(yàn)中獲得的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的MS、B5、N68、VW、N6、ER基本培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.2.3繼代增殖培養(yǎng)以初代誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，考察植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)地楓皮叢生芽的影響，設(shè)計(jì)激素種類和濃度組合為：1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA（B1處理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA（B2處理）、1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B3處理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B4處理）。

1.2.4生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)基：1/2MS+1.0 mg/L NAA（C1處理）、1/2MS+1.0 mg/L IBA（C2處理）、1/2MS+1.0 mg/LIAA（C3處理）。

1.3計(jì)算公式

相關(guān)計(jì)算公式如下：

污染率=污染外植體數(shù)/接種數(shù)×100%；（1）

死亡數(shù)=死亡外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%；（2）

誘導(dǎo)率=出芽外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%；（3）

增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種數(shù)；（4）

誘導(dǎo)率=出芽數(shù)/接種數(shù)×100%。 （5）

2結(jié)果與分析

2.1滅菌時(shí)間篩選

分別設(shè)5、8、10、12 min 4個(gè)滅菌時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，外植體接入初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15 d，記錄污染的外植體數(shù)，統(tǒng)計(jì)污染率。30 d時(shí)分別記錄死亡的外植體數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡率、成功率。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，在不同滅菌時(shí)間里，地楓皮的莖段、頂芽的污染率、死亡率均有差異，其中頂芽滅菌8 min時(shí)效果最好，污染率僅為20%，死亡率為0；而莖段的滅菌時(shí)間以10 min效果最好，污染率為30%，無(wú)死亡（表1、表2）。

2.2初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

外植體培養(yǎng)10～15 d時(shí)，頂芽、腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，長(zhǎng)出小芽（萌芽情況見(jiàn)圖1、圖2）。A3培養(yǎng)基中的萌芽率最高，頂芽誘導(dǎo)為100%，莖段誘導(dǎo)率達(dá)到90%；因此，初代誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（表3）。

將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)出來(lái)的芽接入附加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS、B5、N68、VW、N6、ER培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于不同基本培養(yǎng)基中元素的種類和濃度均有所不同，培養(yǎng) 30 d 時(shí)，在不同培養(yǎng)基中芽的長(zhǎng)勢(shì)、芽數(shù)均有很大區(qū)別，其中MS培養(yǎng)基中的芽壯且數(shù)目較多，而在VW培養(yǎng)基中的芽細(xì)且數(shù)量少。不同培養(yǎng)基中芽的長(zhǎng)勢(shì)從壯到弱順序?yàn)椋篗S>ER>B5>N6>N68>VW。

2.3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)地楓皮繼代增殖的影響

將初代誘導(dǎo)得到的健壯單芽接入附加6-BA、KT、ZT、NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，12 d后形成叢生芽，30 d后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基中的芽數(shù)、增殖系數(shù)，觀察芽的長(zhǎng)勢(shì)。從表4可以看出，培養(yǎng)基B2對(duì)地楓皮增殖作用比較好，增殖系數(shù)為3.2。因此，地楓皮繼代增殖最佳培養(yǎng)基為2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LKT+0.3 mg/L NAA。

2.4生長(zhǎng)素對(duì)地楓皮組培苗生根的影響

地楓皮增殖芽長(zhǎng)至2～3 cm高時(shí)，切分成單芽，接入C1、C2、C3處理3種生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在C1處理培養(yǎng)基中無(wú)菌芽基部膨大，形成大量愈傷組織；在C2、C3處理培養(yǎng)基中均長(zhǎng)根，但根的粗細(xì)和數(shù)量有所不同。其中在C2處理培養(yǎng)基中無(wú)菌芽的根數(shù)較少，為5～10條，根較細(xì)；在C3處理培養(yǎng)基中的無(wú)菌芽根數(shù)較多，為10～20條，粗細(xì)適中（圖3）。因此，地楓皮無(wú)菌芽生根較好的培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg/L IAA（表5）。

2.5煉苗移栽

地楓皮組培苗長(zhǎng)至3～4 cm高時(shí)，根據(jù)地楓皮的生長(zhǎng)特性在溫室內(nèi)將已生根的試管苗煉苗3 d，洗凈試管苗根部的培養(yǎng)基，移栽到滅過(guò)菌的沙子中，成活率為70%。

3結(jié)論與討論

自1937年White建立第1個(gè)植物組織培養(yǎng)基以來(lái)，許多研究者報(bào)道了各種培養(yǎng)基，其數(shù)量多，配方各異。基本培養(yǎng)基

表5植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)地楓皮生根培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基編號(hào)接種數(shù)

（個(gè)）生根數(shù)

（條）生根率

（%）生長(zhǎng)情況C11000基部膨大，大量愈傷組織C21010100根細(xì)，根系少C31010100根粗細(xì)適中，根系多

的篩選對(duì)植物組織培養(yǎng)有著重要的影響。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)飛速發(fā)展，根據(jù)植物種類和部位的不同要求，研制出的基本培養(yǎng)基多達(dá)685種[9]。由于同一科屬植物生長(zhǎng)習(xí)性相近，其所用的基本培養(yǎng)基也相似。地楓皮原生境為巖溶石山山頂，生長(zhǎng)的土壤為黑色石灰土，土壤含有較高的交換性鈣和有機(jī)質(zhì)[10]，本試驗(yàn)研究表明，地楓皮組織培養(yǎng)最適的基本培養(yǎng)基為MS，MS具有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，非常適合地楓皮生長(zhǎng)，與其同科屬八角組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基相同[11]。

在植物組培快速繁殖技術(shù)研究中，為了提高增殖系數(shù)，縮短培育時(shí)間，便于大規(guī)模生產(chǎn)種苗，在其基本培養(yǎng)基中附加不同種類、濃度的激素，以滿足不同培養(yǎng)階段需求。在繼代增殖階段，許多研究已經(jīng)表明細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)叢生芽的增殖[12-13]，本試驗(yàn)以6-BA、ZT、KT與NAA聯(lián)合配比使用，發(fā)現(xiàn)MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA誘導(dǎo)效果較好，芽長(zhǎng)勢(shì)好、葉色翠綠。在生根階段，生長(zhǎng)素類物質(zhì)對(duì)植物生根具有促進(jìn)作用，本試驗(yàn)以NAA、IBA、IAA 3種生長(zhǎng)素與6-BA配比使用，研究不同生長(zhǎng)素對(duì)地楓皮無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明IAA對(duì)地楓皮無(wú)菌芽生根誘導(dǎo)優(yōu)于IBA，NAA可以誘導(dǎo)地楓皮無(wú)菌芽產(chǎn)生愈傷組織，但對(duì)生根誘導(dǎo)作用甚微。 NAA是一種廣譜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)不定根形成的作用[14]，但是在培養(yǎng)過(guò)程中也經(jīng)常出現(xiàn)致使材料老化、形成愈傷組織[15]的現(xiàn)象；而IBA、IAA則是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長(zhǎng)素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)，誘導(dǎo)形成不定根[16-21]。

綜上所述，在地楓皮組培快繁技術(shù)研究中，地楓皮的莖段、頂芽均可作為組織培養(yǎng)的外植體，MS為較適合的基本培養(yǎng)基，初代誘導(dǎo)較好的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA，增殖系數(shù)為3.2；最佳生根培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg/L IAA。本研究為地楓皮種苗繁育打下良好的基礎(chǔ)，也為地楓皮良種選育提供技術(shù)平臺(tái)。

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