氣調(diào)包裝處理對生鮮薺菜豬肉餡中微生物的影響

王俊姣,高倩妮,葉可萍,李冉,高廷軒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

調(diào)理肉制品又稱預(yù)制肉制品,是以畜禽或水產(chǎn)品為主要原料,添加適量的調(diào)味料或輔料,經(jīng)適當(dāng)加工,以包裝或散裝形式在一定溫度下儲存銷售,可直接食用或經(jīng)簡單加工即可食用的肉制品[1-2]。因調(diào)理肉制品食用方便,免除了清洗、切割、調(diào)理等步驟,更適應(yīng)現(xiàn)代社會的快節(jié)奏生活,其已成為我國城市人群和發(fā)達國家消費的主要肉制品種類[2]。隨著冷鏈技術(shù)的成熟,冰箱和微波爐的普及,調(diào)理肉制品逐漸從方便儲存、方便保鮮開始向家庭菜肴轉(zhuǎn)變,超市常見的有青椒肉絲、紅燒肉、黃燜雞、宮保雞丁等[2-4]。薺菜豬肉餡是以豬肉和薺菜為主要原料,經(jīng)分割、整形、調(diào)制、攪拌而成的中式調(diào)理肉制品[5],其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,但該產(chǎn)品在工廠的生產(chǎn)過程中未經(jīng)熱殺菌處理,因此貨架期較短,難以進行長途運輸,大大限制了該產(chǎn)品的銷路。

對于中式調(diào)理肉制品,我國主要使用天然的抑菌物質(zhì)或氣調(diào)包裝以達到保鮮效果[3-4,6-8],如使用乳酸鏈球菌素能將生鮮青椒肉絲的保鮮期延長至10 d;氣調(diào)包裝可以將烤鴨腿的貨架期延長至21 d等。氣調(diào)包裝(MAP)也稱置換氣體包裝,采用具有氣體阻隔性能的包裝材料,根據(jù)實際生產(chǎn)需求充入不同比例的CO2、N2等混合氣體,調(diào)節(jié)貯藏的氣體環(huán)境從而達到食品保鮮的目的[9]。氣調(diào)包裝能夠保持食品原有的口感、色澤及營養(yǎng)物質(zhì),受到眾多食品生產(chǎn)者的青睞[10],是一項應(yīng)用范圍越來越廣泛的食品包裝新技術(shù)。目前國內(nèi)外關(guān)于氣調(diào)包裝在調(diào)理肉制品方面的研究以單一的肉類為主[7-8,11-13],如調(diào)理牛排、醬鹵鴨翅等,但在肉、菜相結(jié)合菜肴方面的研究較少,僅在黃桂龍[14]的研究中涉及到了豬肉和少量淀粉的結(jié)合。由于地區(qū)飲食的差異,國外更無相關(guān)經(jīng)驗可供參考,因此,氣調(diào)包裝在肉餡類菜肴的應(yīng)用上仍有較大的研究空間。

薺菜豬肉餡為冷藏生鮮食品,據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《冷藏食品物流包裝、標(biāo)志、運輸和儲存:GB/T 24616—2009》規(guī)定,冷藏食品在冷鏈物流過程中的中心溫度必須維持在 8 ℃ 以下,然而在冷鏈運輸過程中,由于裝卸貨物的實際需要,冷藏車需要開門作業(yè),此時車門處產(chǎn)生強烈的熱濕交換,使得貯藏環(huán)境溫度上升[15-16]。研究表明,有塑料門簾的冷藏車在開門后2 min內(nèi)溫度即由-10 ℃上升至8 ℃[17]。到了銷售終端,根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《超市銷售生鮮農(nóng)產(chǎn)品基本要求:GB/T 22502—2008》,超市銷售生鮮產(chǎn)品所配備的冷藏柜一般為 0～5 ℃,但是在銷售過程中因消費者取貨而多有變動。研究表明,環(huán)境溫度每升高2 ℃,臥式敞開式冷藏陳列柜中的食品溫度平均升高0.1～0.3 ℃[18],導(dǎo)致其實際溫度高于設(shè)定溫度。因此,為更實際反映產(chǎn)品在流通及銷售過程中的情況,從而更好指導(dǎo)食品企業(yè)的生產(chǎn),本試驗將貯藏溫度設(shè)定為8 ℃。

近年來,高通量測序借助16S rDNA/rRNA 分析技術(shù)能夠較為全面地檢測樣品中的微生物種類,有利于研究者準(zhǔn)確分析菌群結(jié)構(gòu)[19]。因此,本試驗將薺菜豬肉餡進行氣調(diào)包裝,在8 ℃條件下貯藏,每天監(jiān)測樣品包裝頂空氣體組成的變化,在采用傳統(tǒng)的平板計數(shù)法對特定微生物進行計數(shù)的同時,使用高通量測序技術(shù)分析薺菜豬肉餡貯藏過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化,旨在揭示貯藏末期樣品的優(yōu)勢腐敗菌,并為氣調(diào)包裝在薺菜豬肉餡中的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薺菜豬肉餡取自江蘇省某食品有限公司。平板計數(shù)瓊脂(PCA)、MRS培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨(BPW)、氯化鈉均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司,無菌均質(zhì)袋購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

主要儀器有:氣體分析儀(WITT OXYBABY6.0),拍擊式均質(zhì)器(BagMixer,Interscience),pH計(METTLE TOLEDO),氣調(diào)包裝機(ULMA,SMART500),恒溫恒濕箱(BINDER),PCR儀(9700型ABI GeneAmp?),MiSeq 測序儀(美國Illumina)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集及貯藏取若干袋新鮮制作的樣品,低溫(小于4 ℃)運回實驗室。原始樣品為500 g規(guī)格的密封塑料袋包裝,平均分為5組,其中1組不作任何處理,作為對照組(CK),其余4組采用不同氣體比例的氣調(diào)包裝,分別為100%N2、30%CO2+70%N2、40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2,每個處理3個重復(fù)。所有樣品均置于8 ℃的恒溫恒濕箱中貯藏,每天取樣進行相關(guān)指標(biāo)的測定,直至樣品徹底腐敗。

1.2.2 感官評定由10人構(gòu)成的感官評定小組,每天對樣品進行感官評定。評定內(nèi)容包括包裝外觀、氣味、組織狀態(tài)、色澤、總體可接受度5個方面,最高分為10分,最低分為1分。評定結(jié)果取10人的平均值,當(dāng)綜合評分小于5分時,認(rèn)為產(chǎn)品感官不可接受。具體評價指標(biāo)見表1。

表1 薺菜豬肉餡感官質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard for sensory quality of shepherd’s purse pork stuffing

1.2.3 氣體比例測定將氣體比例測定儀的探頭插入不同處理組的氣調(diào)包裝盒中,測定氣調(diào)包裝盒頂空CO2的氣體比例,每個處理3個重復(fù)。

1.2.4 pH值測定參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定:GB5009.237 — 2016》的方法,取5 mL均質(zhì)后的處理液于滅菌離心管中,加入45 mL pH7.0的去離子水,振蕩混勻后用pH計測定pH值。

1.2.5 微生物測定菌落總數(shù)測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定:GB4789.2—2016》方法進行;乳酸菌數(shù)測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗:GB4789.35—2016》方法進行;腸桿菌數(shù)測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗 腸桿菌檢驗:GB4789.41—2016》方法進行,結(jié)果均以lg(CFU·g-1)表示。

1.2.6 DNA提取及高通量測序每天取各處理組的樣品5 g左右,參照試劑盒完成樣品基因組DNA的抽提,并通過10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。以提取的總DNA為模板,對細(xì)菌的16S rDNA 的 V3—V4 區(qū)設(shè)計特異引物并進行PCR擴增,特異性引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。反應(yīng)程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共27個循環(huán);72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物用20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,并用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測,將PCR產(chǎn)物通過Illumina MiSeq PE250平臺進行 DNA 測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS V8.01軟件的Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析。采用GraphPad Prism 5(Version 5.01 2007)軟件繪制折線圖。將Illumina MiSeq PE250測序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系拼接,同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣本后進行物種分類學(xué)分析。基于分類學(xué)信息,可以在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。使用R語言工具繪制菌群結(jié)構(gòu)組分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中氣調(diào)包裝頂空CO2含量及薺菜豬肉餡pH值的變化

由圖1可見:氣調(diào)包裝組在貯藏初期均達到預(yù)設(shè)的氣體環(huán)境,100%N2組的CO2含量隨貯藏時間延長而上升;含CO2的氣調(diào)包裝組(30%CO2+70%N2、40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2)CO2含量 0～3 d時不斷下降,3 d后CO2含量隨貯藏時間的延長而增加,最終高于初始CO2含量。0 d時樣品pH值在6.5左右,隨著貯藏時間的延長,樣品pH值逐漸下降,其中,含CO2的氣調(diào)包裝組樣品pH值均低于不含CO2氣調(diào)包裝組(CK和100%N2組),CO2含量高的氣調(diào)包裝組樣品的pH值低于CO2含量低的氣調(diào)包裝組。

圖1 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在8 ℃貯藏期間頂空CO2含量及pH值變化Fig.1 Changes of CO2 content and pH value in shepherd’s purse pork stuffing with different modified atmosphere packing during storage at 8 ℃不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level. The same as follows.

2.2 不同氣調(diào)包裝薺菜豬肉餡在貯藏過程中感官品質(zhì)的變化

從圖2可知:0 d時薺菜豬肉餡組織緊密,富有彈性,且薺菜呈鮮綠色,豬肉油潤有光澤,貯藏前期樣品的感官品質(zhì)下降較為緩慢;4 d時對照組樣品的感官評分均低于各處理組,對照組的肉餡顏色輕微發(fā)白,薺菜略微發(fā)黃,有漲袋傾向,并且在“總體可接受程度”方面最先呈現(xiàn)“不可接受”,其他處理組總體處于“勉強接受”,其中50%CO2+50%N2處理組在包裝外觀方面優(yōu)于其他處理組,而在色澤氣味等感官特性上與其他處理組無顯著差異。值得注意的是,4 d時,所有樣品的感官評分與2 d時相比有明顯下降,部分樣品出現(xiàn)可被肉眼覺察的腐敗癥狀;6 d時所有樣品均有明顯的汁液滲出和漲袋現(xiàn)象,已經(jīng)完全腐敗。

圖2 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在8 ℃貯藏期間的感官變化Fig.2 Sensory changes of shepherd’s purse pork stuffing with different modified atmosphere packaging during storage at 8 ℃

2.3 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在貯藏過程中微生物的數(shù)量變化

由圖3可見:樣品初始菌落總數(shù)為104.6CFU·g-1左右,說明樣品在制作過程中被輕微污染;對照組和30%CO2+70%N2組的菌落總數(shù)在貯藏過程中不斷增加,而100%N2、40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2組的菌落總數(shù)在2 d時明顯下降,說明氣調(diào)包裝處理在此時具有一定效果;3～4 d時,氣調(diào)包裝組的菌落總數(shù)均大于105.5CFU·g-1,感官評定結(jié)果表明此時的樣品已經(jīng)出現(xiàn)輕微的腐敗癥狀;5～6 d時,樣品的菌落總數(shù)均超過106.5CFU·g-1,而我國《調(diào)理肉制品加工技術(shù)規(guī)范:NYT 2073—2011》規(guī)定菌落總數(shù)最高安全限量為106CFU·g-1(4 ℃條件下),說明此時樣品已經(jīng)完全腐敗。含CO2氣調(diào)包裝組(30%CO2+70%N2、40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2組)的乳酸菌數(shù)量在貯藏前期顯著低于不含CO2的處理組(對照組和100%N2組),尤其是50%CO2+50%N2組。2 d時,40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2處理組的腸桿菌數(shù)低于其他處理組(對照組、100%N2、30%CO2+70%N2組);3 d時所有氣調(diào)包裝組腸桿菌的數(shù)量突增。50%CO2+50%N2組在整個貯藏過程中均對腸桿菌科有良好的抑制作用。

圖3 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在8 ℃貯藏期間的微生物數(shù)量Fig.3 The microbial counts of shepherd’s purse pork stuffing with different modified atmosphere packaging during storage at 8 ℃

2.4 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化

由圖4可見:對照組和氣調(diào)包裝組的菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。1～2 d,嗜冷菌(Psychrobactersp.)為對照組的優(yōu)勢菌,相對豐度達70%,由于嗜冷菌是需氧菌,其相對豐度隨環(huán)境中氧氣的減少而下降;3 d時嗜冷菌的相對豐度只有5%,同時,肉食桿菌(Carnobacteriumsp.)兼性厭氧,其相對豐度由4%增加至35%左右;5 d時肉食桿菌屬和嗜冷菌屬共同成為樣品的優(yōu)勢菌群,相對豐度分別占40%和30%,另外還有4%左右的假單胞菌、乳球菌、鏈球菌等。4種氣調(diào)包裝組的菌群結(jié)構(gòu)較為相似,均以沙雷氏菌(Serratiasp.)、氣單胞菌(Aeromonassp.)為主要優(yōu)勢菌,同時有乳球菌、肉食桿菌、假單胞菌、乳桿菌等,但具體比例不同。1 d時,含有CO2的氣調(diào)包裝組(30%CO2+70%N2、40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2)優(yōu)勢菌均為氣單胞菌和假單胞菌,其平均相對豐度分別為9%和10%;3 d時肉食桿菌和沙雷氏菌相對豐度分別為6%和20%;5 d時,50%CO2+50%N2組中的沙雷氏菌相對豐度略低于其他氣調(diào)包裝組,乳球菌相對豐度(25%)高于其他氣調(diào)包裝組,氣單胞菌(12%)和肉食桿菌(5%)豐度相似,沙雷氏菌(23%)豐度較低。

圖4 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在8 ℃貯藏期間的菌群結(jié)構(gòu)(屬水平)Fig.4 The bacterial composition of shepherd’s purse pork stuffing with different modified atmosphere packaging during storage at 8 ℃(genus level)

3 討論與結(jié)論

3.1 貯藏過程中氣調(diào)包裝頂空CO2含量及薺菜豬肉餡pH值的變化

本研究結(jié)果表明,CO2含量在100%N2組貯藏全程不斷增加,而在其他氣調(diào)包裝組中先下降再增加。CO2含量增加可能是微生物在代謝過程中產(chǎn)生了CO2,而CO2含量下降可能是CO2溶解于肉中,形成酸性物質(zhì),從而降低樣品的pH值[12,20-22]。

較低的pH值會營造酸性環(huán)境,抑制部分微生物的生長,從本文的感官評定結(jié)果上看,高濃度CO2引起的低pH值環(huán)境并沒有破壞薺菜豬肉餡的食用品質(zhì),因此50%CO2+50%N2組更有利于維持肉餡在貯藏過程中的新鮮度。

3.2 不同氣調(diào)包裝薺菜豬肉餡在貯藏過程中感官品質(zhì)的變化

感官評定是衡量食品品質(zhì)直接且重要的指標(biāo),在消費者購買產(chǎn)品時起決定作用[13]。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)高CO2氣調(diào)包裝在黃羽雞的各項感官指標(biāo)中得分最高。本試驗結(jié)果顯示,50%CO2+50%N2處理組在包裝外觀方面優(yōu)于其他處理組,而在色澤氣味等感官特性上與其他處理組無顯著差異。

本試驗發(fā)現(xiàn),4 d時所有樣品的感官評分與2 d時相比有明顯下降,表明2～4 d是薺菜豬肉餡品質(zhì)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期,對特定微生物的計數(shù)也支持這一結(jié)果;6 d時樣品汁液滲出可能是由于鮮肉里蛋白質(zhì)持水力下降,漲袋可能是厭氧產(chǎn)氣菌的大量繁殖導(dǎo)致的。

3.3 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在貯藏過程中微生物的數(shù)量變化

本試驗的樣品初始菌落總數(shù)為104.6CFU·g-1左右,略高于正常值,這主要是由于薺菜豬肉餡在制作過程中未經(jīng)熱殺菌處理,并且制作時的空氣溫度和濕度較高,有利于細(xì)菌的繁殖。研究表明,樣品初始菌落總數(shù)對氣調(diào)效果有較大影響,當(dāng)樣品的初始菌落達到105CFU·g-1時,氣調(diào)幾乎沒有效果[24]。因此在生鮮調(diào)理肉制品的生產(chǎn)過程中,降低產(chǎn)品的初始菌落總數(shù)從而延長產(chǎn)品貨架期是非常必要的。

本試驗發(fā)現(xiàn)CO2能抑制肉餡中乳酸菌的生長,且CO2濃度越高抑制效果越好。這一結(jié)果與Zhang等[23]在研究氣調(diào)包裝黃羽雞的貨架期時的結(jié)論基本一致。腸桿菌科細(xì)菌常與菌落總數(shù)共同指示食品的衛(wèi)生狀況[25],且被認(rèn)為是食品在氣調(diào)包裝條件下的主要菌群,因此,我們測定了樣品中腸桿菌的數(shù)量。結(jié)果表明:40%以上的CO2能顯著抑制腸桿菌科細(xì)菌的生長,這與已有的研究結(jié)果[24,26]相一致。

本試驗結(jié)果表明,40%CO2+60%N2、50%CO2+50%N2組對菌落總數(shù)、乳酸菌和腸桿菌均有抑制作用,但抑制效果有所不同,其中高濃度CO2組即50%CO2+50%N2表現(xiàn)出更穩(wěn)定更持續(xù)的抑菌效果。

3.4 不同氣調(diào)包裝的薺菜豬肉餡在貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化

本研究中,對照組嗜冷菌(Psychrobactersp.)在2～3 d時相對豐度下降,可能是由于嗜冷菌是需氧菌,其數(shù)量隨氧氣的消耗逐漸減少,而肉食桿菌(Carnobacteriumsp.)是兼性厭氧菌,因此其相對豐度由4%增至35%左右。在缺氧條件下,嗜冷菌無法與兼性厭氧的肉食桿菌在含蛋白質(zhì)的食物中競爭,因此肉食桿菌可能在塑料袋包裝的樣品中發(fā)揮了主要致腐作用[27-28]。本試驗氣調(diào)包裝組中,假單胞菌在貯藏前期占據(jù)優(yōu)勢,但其對CO2敏感,因此3 d之后幾乎消失[29];氣單胞菌(Aeromonassp.)是腸桿菌科的兼性厭氧菌,在貯藏全程一直處于優(yōu)勢地位,它可能來自制作過程中所用的水[30];沙雷氏菌(Serratiasp.)是肉中的主要致腐菌之一,其常見于氣調(diào)包裝的生肉中,隨著貯藏時間的延長,沙雷氏菌持續(xù)占據(jù)優(yōu)勢[31]。本研究中,貯藏末期50%CO2+50%N2組的菌群組成與其他處理組出現(xiàn)了差異,其擁有與其他處理組相似豐度的氣單胞菌(12%)和肉食桿菌(5%),也擁有豐度相對較低的沙雷氏菌(23%)和較高豐度的乳球菌(25%)。

基于以上分析,我們認(rèn)為在100%N2組中發(fā)揮主要致腐作用的是腸桿菌(主要是沙雷菌屬、氣單胞菌屬)和乳酸菌(肉食桿菌屬),在含CO2氣調(diào)包裝組中發(fā)揮主要致腐作用的是腸桿菌(沙雷菌屬、氣單胞菌屬)和乳酸菌(乳球菌屬)。

本研究表明,相比其他處理組,50%CO2+50%N2氣調(diào)包裝組中CO2比例更高,pH值更低,最利于樣品的貯藏,感官指標(biāo)表現(xiàn)良好,對乳酸菌和腸桿菌抑制能力最強。對菌群結(jié)構(gòu)的研究表明,氣調(diào)會顯著改變樣品的菌群組成,對照組樣品中的優(yōu)勢腐敗菌是乳酸菌(肉食桿菌屬),氣調(diào)包裝組樣品在貯藏末期主要優(yōu)勢菌是腸桿菌科細(xì)菌(沙雷菌屬、氣單胞菌屬)和乳酸菌(乳球菌屬),CO2濃度不同會導(dǎo)致不同處理間優(yōu)勢腐敗菌相對豐度的差異。本研究可以為氣調(diào)包裝在薺菜豬肉餡中的應(yīng)用提供一定的理論參考。