多年生和一年生蕎麥根系生理特性比較研究

唐 彬，黃 娟，王璐瑗，陳慶富，榮玉萍，任蓉蓉

（貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴陽550001）

人類糧食供給主要依賴于禾本科、豆科以及其他科一年生作物，如水稻、小麥、玉米、大豆、高粱、蕎麥等，這些糧食作物生產(chǎn)模式存在勞動力缺乏導(dǎo)致土地荒廢和過度依賴化肥農(nóng)藥造成農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)破壞嚴重等亟待解決的問題，制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展[1-3]。多年生作物是指可多年生長，或地上部分在冬季枯萎，次年繼續(xù)生長和開花結(jié)實的作物[1]。多年生作物一方面可節(jié)約生產(chǎn)投入成本，減少勞動力使用，有效解決貧困山區(qū)土地荒廢問題[2]；另一方面因多年生作物根系更發(fā)達，可加強對土壤水分和養(yǎng)分固定和利用，對土壤具有一定修復(fù)作用[1]。因此，多年生作物日益受到關(guān)注，多年生糧食作物育種研究在美國、澳大利亞、加拿大、中國等相繼開展，涉及多年生小麥、多年生玉米和多年生水稻等多種作物[4-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，一年生作物與多年生作物在根系拓撲結(jié)構(gòu)和形態(tài)上存在差異，多年生作物根系更為粗壯和發(fā)達[5,7]。可越冬的多年生作物根系具備強大抗寒和再生能力，在生理水平上，抗寒能力主要表現(xiàn)在逆境脅迫相關(guān)保護酶活性，再生力主要表現(xiàn)在與植物生長發(fā)育相關(guān)的植物激素[8-10]。胡飛和劉銘銘報道稱多年生玉米和一年生玉米在生長期間根系形態(tài)指標、可溶性糖和干物質(zhì)積累以及根系解剖結(jié)構(gòu)存在差異[5,11]。植物細胞內(nèi)SOD、CAT和POD等抗氧化酶積累與植物抗寒性有關(guān)，在水稻、玉米和多年生小麥等多種植物上有報道[5-6,12]。此外，抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）對維持低溫脅迫下植物細胞膜結(jié)構(gòu)完整性具有重要作用[8]。地下根莖再生是多年生水稻區(qū)別于栽培水稻的重要特征[13]，對多年生野生稻不同組織部位和再生根不同部位開展比對轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定得到在多年生野生稻根中特異性表達基因，發(fā)現(xiàn)生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）等激素類基因可能在多年生水稻地下根再生和莖形成中具有重要調(diào)控作用[7]。

蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopy?rum），包括一年生蕎麥如甜蕎（F.esculentum）、苦蕎（F.tataricum）和多年生蕎麥如金蕎麥（F.cymo?sum）等主要品種[14-15]。一年生甜蕎和苦蕎是目前主要栽培品種，其根系較短且側(cè)根少，無法越冬，每個生長季均需種植，耗時耗力。多年生金蕎麥根系膨大粗壯，可形成膨大塊根，且側(cè)根發(fā)達，可越冬，實現(xiàn)一次栽培，年年收獲[2]。近年來選育的新種金苦蕎是金蕎麥與苦蕎雜交后代，其地下根莖介于一年生蕎麥和多年生蕎麥之間，根系大于一年生蕎麥且側(cè)根發(fā)達，但不具有膨大塊根。雖具一定越冬性，但在極其寒冷地區(qū)無法越冬[16]。一年生蕎麥和多年生蕎麥根系在形態(tài)上具有較大差異，但在生理水平上差異尚未見報道。

本研究以可越冬多年生蕎麥、無法越冬一年生蕎麥以及介于二者間具有部分越冬特性的金苦蕎為研究對象，在其根系發(fā)育不同階段，測定其他物種中報道的與多年生特性相關(guān)的3種內(nèi)源激素（IAA、GA、CTK）含量和7種保護酶（SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST、APX）活性，探究多年生蕎麥和一年生蕎麥在發(fā)育期內(nèi)上述生理指標動態(tài)變化關(guān)系，明確多年生蕎麥與一年生蕎麥根中內(nèi)源激素含量和酶活性差異關(guān)鍵時期，為從生理水平探討多年生和一年生作物根系差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為兩個一年生蕎麥品種品苦1號（F.tataricum）和貴甜2號（F.esculentum）、兩個多年生品種紅心金蕎（F.cymosum）和大野蕎（F.megaspar?tanium）以及一個介于二者間的金苦蕎（F.tatari-cy?mosum），由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心保存并提供。

試驗材料種植于貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心生長室，采取盆栽試驗，所用土壤為黃土壤，采用常規(guī)栽培措施管理。在不同發(fā)育時期（四葉期、孕蕾期、初花期、盛花期）對蕎麥地下根取樣，每個樣品至少取3株長勢一致植株地下根，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。取樣時將整株植株挖起，清水洗凈根上泥土，用吸水紙輕輕擦干根表面水，一年生蕎麥切取地下直根系，多年生蕎麥切取地下膨大塊根，取樣后，根立即放入液氮中速凍，之后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)源激素提取與測定

參照吳頌如等酶聯(lián)免疫法（ELISA）[17]，略有改動。提取蕎麥地下根中植物激素，提取方法為：稱取樣品0.1 g置于預(yù)冷研缽中，用80%甲醇溶液（內(nèi)含10 mg·L-1丁羥甲苯BHT）研磨成勻漿，靜置片刻后吸取上清液于離心管中，4 000 r·min-1離心15 min，取沉淀后用80%甲醇重復(fù)提取3次，合并上清液，即為激素萃取液。CTK、IAA和GA含量測定采用植物ELISA檢測試劑盒（購自于上海優(yōu)選生物科技有限公司），CTK試劑盒貨號為YX032-011P，IAA試劑盒貨號為YX-090101P，GA試劑盒貨號為YX-070100P。3種激素測定方法按照試劑盒說明書操作。每份樣品2次技術(shù)重復(fù)測定。

1.2.2 生理指標測定

1.2.2.1酶粗提液制備

酶粗提液制備方法參考Giannoplitis和Ries方法[18]，略有改動。樣品在研缽中加液氮研磨至粉末，精確稱取0.3 g樣品，加入2 mL提取液（0.05 mol·L-1PBS緩沖液，pH 7.0，含2 mmol·L-1EDTA）于渦旋震蕩儀上迅速勻漿，4℃下10 000 r·min-1離心15 min，取上清液，即為酶粗提液。

1.2.2.2生理指標測定

SOD活性測定分析參考Giannoplitis和Ries方法[18]，CAT活性分析參考Aebi方法[19]，POD活性分析參照Hendriks等方法[20]，GPX活性分析參考黃愛纓等方法[21]，GR活性分析參考Foyer和Halliwell方法[22]，GST活性測定按照GST活性測定試劑盒（YX-W-A204，購自于上海優(yōu)選生物科技有限公司）方法，APX活性分析參考Chen和Asada方法[23]。每份樣品2次技術(shù)重復(fù)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)并繪表，利用SPSS 23.0作數(shù)據(jù)方差和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多年生和一年生蕎麥根系內(nèi)源激素含量比較

2.1.1 生長素（IAA）含量比較

由表1可知，兩個多年生蕎麥（紅心金蕎和大野蕎）IAA含量在孕蕾期到初花期明顯下降，兩個一年生蕎麥（品苦1號和貴甜2號）IAA含量在發(fā)育時期呈逐漸上升趨勢，金苦蕎IAA含量無明顯變化。多年生蕎麥在四葉期和孕蕾期IAA含量顯著高于一年生蕎麥，隨后在初花期急劇下降，一年生蕎麥IAA含量在各個時期持續(xù)上升，表明多年生和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中IAA含量差異形成關(guān)鍵時期是初花期。5個品種中，紅心金蕎IAA含量在各發(fā)育期均顯著高于其他品種。

表1 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中IAA含量比較Table 1 Comparison of IAA content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.1.2赤霉素（GA）含量比較

由表2可知，兩個多年生蕎麥（紅心金蕎和大野蕎）GA含量在孕蕾期到初花期明顯下降，兩個一年生蕎麥（品苦1號和貴甜2號）GA含量在四葉期到初花期呈逐漸上升趨勢，金苦蕎GA含量在孕蕾期到盛花期呈上升趨勢。多年生蕎麥GA含量在四葉期到孕蕾期顯著高于一年生蕎麥，隨后在初花期急劇下降，一年生蕎麥在初花期GA含量呈上升趨勢，表明多年生和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中GA含量差異形成關(guān)鍵時期是初花期。5個品種中，紅心金蕎GA含量在各發(fā)育期均顯著高于其他品種。

表2 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中GA含量比較Table 2 Comparison of GA content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.1.3 細胞分裂素（CTK）含量比較

由表3可知，兩個多年生蕎麥（紅心金蕎和大野蕎）CTK含量在發(fā)育期無顯著變化，一年生蕎麥（品苦1號、貴甜2號和金苦蕎）CTK含量波動幅度大，品苦1號從孕蕾期到初花期CTK含量大幅度上升，到盛花期又急劇下降，貴甜2號CTK含量呈先降后升趨勢，金苦蕎變化趨勢與之相反。兩個多年生蕎麥（紅心金蕎和大野蕎）CTK含量在各發(fā)育期均顯著低于兩個一年生蕎麥（品苦1號和金苦蕎）。多年生和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中CTK含量變化存在顯著差異。

表3 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中CTK含量比較Table 3 Comparison of CTK content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.2 多年生和一年生蕎麥根系生理指標含量比較

2.2.1 SOD活性比較

如表4所示，兩個多年生蕎麥（紅心金蕎和大野蕎）SOD活性變化趨勢大致相同，均呈先增后降趨勢，兩個一年生蕎麥（品苦1號和貴甜2號）呈先降后升再降趨勢，金苦蕎SOD活性在孕蕾期急劇下降，至初花期又大幅上升，之后無明顯變化。除金苦蕎外，多年生和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中SOD活性變化差異不顯著。

表4 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中SOD活性比較Table 4 Comparison of SOD activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (U·g-1)

2.2.2 CAT活性比較

如表5所示，多年生蕎麥紅心金蕎和大野蕎CAT活性呈先降再升趨勢，一年生蕎麥品苦1號和貴甜2號呈先升后降趨勢，以上四種蕎麥CAT活性變化波動幅度均較小，未達到顯著性差異。金苦蕎CAT活性變化與多年生蕎麥變化趨勢相同，但金苦蕎波動幅度較大。

表5 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中CAT活性比較Table 5 Comparison of CAT activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.3 POD活性比較

如表6所示，多年生蕎麥紅心金蕎和大野蕎POD活性變化相同，四葉期到孕蕾期呈下降趨勢，之后處于一個平穩(wěn)狀態(tài)，無明顯增加或減少趨勢。一年生蕎麥金苦蕎和品苦1號POD活性具有相似變化趨勢，均呈先降后升再降趨勢，貴甜2號呈先降后升趨勢。各時期多年生蕎麥根系中POD活性顯著低于一年生蕎麥，多年生蕎麥和一年生蕎麥根系POD活性變化在發(fā)育期存在顯著差異，一年生蕎麥POD活性在初花期出現(xiàn)上升趨勢，多年生無明顯變化，表明初花期是一年生蕎麥和多年生蕎麥根部位POD活性變化形成差異關(guān)鍵時期。

表6 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中POD活性比較Table 6 Comparison of POD activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.4 GPX活性比較

如表7所示，多年生蕎麥中紅心金蕎GPX活性從四葉期到盛花期穩(wěn)定上升；大野蕎GPX活性呈先降后升趨勢。一年生蕎麥GPX活性變化波動較大，品苦1號呈先降后升再降趨勢，變化幅度大；貴甜2號呈先降后升趨勢，金苦蕎呈先升后降趨勢。多年生蕎麥和一年生蕎麥根系中GPX活性變化在發(fā)育期差異不顯著。

表7 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中GPX活性比較Table 7 Comparison of GPX activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (U·g-1·min-1 FW)

2.2.5 GR活性比較

如表8所示，多年生蕎麥紅心金蕎GR活性呈先升后降再升趨勢，大野蕎呈先降后升趨勢。一年生蕎麥品苦1號和貴甜2號GR活性變化趨勢接近，均呈先升后降再升趨勢。金苦蕎GR活性呈先降后升趨勢，與大野蕎變化趨勢接近。多年生蕎麥各個發(fā)育期根系中GR活性高于一年生蕎麥，多年生蕎麥和一年生蕎麥根系中GR活性變化在發(fā)育期存在顯著差異。5個品種中，金苦蕎根系中GR活性在各發(fā)育期均低于其他品種。

表8 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中GR活性比較Table 8 Comparison of GR activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.6 GST活性比較

如表9所示，多年生蕎麥紅心金蕎和大野蕎GST活性變化趨勢相同，變化幅度小，一年生蕎麥品苦1號和貴甜2號GST活性均呈先升后降再升趨勢，金苦蕎各時期GST活性無變化。多年生蕎麥各時期根系中GST活性顯著低于一年生蕎麥，多年生蕎麥和一年生蕎麥根系中GST活性變化在發(fā)育期存在顯著差異，多年生蕎麥紅心金蕎和大野蕎GST活性在四葉期到初花期呈逐漸上升趨勢，一年生蕎麥在孕蕾期到初花期呈下降趨勢，表明多年生和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中GST活性差異形成關(guān)鍵時期是初花期。

表9 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中GST活性比較Table 9 Comparison of GST activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·mL-1)

2.2.7 APX活性比較

如表10所示，整個發(fā)育期多年生蕎麥根系中APX活性顯著低于一年生蕎麥，多年生蕎麥紅心金蕎和大野蕎APX活性從孕蕾期開始變化趨勢一致，差異不顯著，且兩者各個時期APX活性變化幅度小。一年生蕎麥品苦1號和貴甜2號APX活性變化均呈先降后升再降趨勢，金苦蕎APX活性呈逐漸上升趨勢，且從孕蕾期到初花期APX活性變化不明顯。一年生蕎麥APX活性在初花期呈上升趨勢，多年生蕎麥APX活性下降，表明初花期是一年生蕎麥和多年生蕎麥根部位APX活性變化形成差異關(guān)鍵時期。

表10 多年生和一年生蕎麥不同發(fā)育期根系中APX活性比較Table 10 Comparison of APX activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.3 多年生和一年生蕎麥根系內(nèi)源激素和生理指標相關(guān)分析

內(nèi)源激素和生理指標相關(guān)性分析表明（見表11），IAA與GA含量呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)（R=0.814），與CAT活性呈顯著（P<0.05）負相關(guān)（R=-0.454）；GA含量與GR活性呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)（R=0.602），與GST活性呈極顯著（P<0.01）負相關(guān)（R=-0.669），與CTK含量（R=-0.446）、POD活性（R=-0.543）及APX活性（R=-0.489）呈顯著（P<0.05）負相關(guān)；CTK含量與POD活性（R=0.720）及GST（R=0.609）活性呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)，與APX活性呈顯著（P<0.05）正相關(guān)（R=0.451），與GR活性呈極顯著（P<0.01）負相關(guān)（R=-0.730）；SOD活性與GPX活性呈顯著（P<0.05）正相關(guān)（R=0.473）；CAT活性與POD活性（R=0.447）及GST活性（R=0.466）呈顯著（P<0.05）正相關(guān)；POD活性與GST活性（R=0.773）及APX活性（R=0.700）呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)，與GR活性（R=-0.637）呈極顯著（P<0.01）負相關(guān)；GR活性與GST活性（R=-0.755）及APX活性（R=-0.695）呈極顯著（P<0.01）負相關(guān)；GST活性與APX活性（R=0.793）呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)。表明內(nèi)源激素和指標間存在一定相關(guān)性，根據(jù)其相關(guān)性，可將其劃分為3類，第一類為IAA、GA、GR，三者間呈正相關(guān)關(guān)系；第二類為CAT、CTK、POD、GST、APX，呈正相關(guān)；第三類為SOD和GPX，兩者間呈正相關(guān)關(guān)系。其中第一類和第二類間呈負相關(guān)，且兩類指標均與第三類無相關(guān)性。

表11 內(nèi)源激素和生理指標相關(guān)分析Table 11 Correlation analysis of endogenous hormones and physiological indices

3 討論與結(jié)論

植物生長發(fā)育受內(nèi)源激素系統(tǒng)調(diào)控，對滇重樓、甘薯和多年生水稻等植物研究表明，植物內(nèi)源激素（IAA、GA、CTK）在促進根莖和塊根生長和膨大過程中發(fā)揮重要作用，在多年生地下根再生和莖形成中具有重要調(diào)控作用[7,24-25]。植物在受到低溫傷害時，細胞膜發(fā)生膜脂過氧化，產(chǎn)生大量活性氧（如超氧陰離子和過氧化氫），導(dǎo)致質(zhì)膜過氧化。此時，植物自身活性氧清除系統(tǒng)（如SOD、CAT、POD等）產(chǎn)生，以減輕活性氧對植物傷害。SOD是植物清除活性氧第一個酶，其催化超氧陰離子歧化生成氧氣和過氧化氫。CAT、POD、APX等酶與過氧化氫發(fā)生反應(yīng)將其清除[26]。對水稻、多年生玉米和多年生小麥研究表明，SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST和APX等保護酶活性是評價植物抗寒性的重要指標，且植物抗寒性與越冬性強度相關(guān)，越冬性強品種其保護酶活性高于越冬性弱品種[5-6,12]。本研究多年生蕎麥和一年生蕎麥根系發(fā)育過程中，SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST和APX等7種酶活存在顯著差異，可能與多年生和一年生蕎麥抗寒性差異有關(guān)，造成多年生與一年生蕎麥越冬性存在差異。

在10個測試指標中，IAA、GA、POD、GST和APX等5個指標在初花期趨勢出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，表明多年生和一年生蕎麥根系差異關(guān)鍵時期可能在初花期。一年生蕎麥需在當季完成開花結(jié)實，需用更多物質(zhì)和營養(yǎng)開展生殖生長以完成其生命周期。多年生蕎麥則將更多物質(zhì)和營養(yǎng)用于根系生長，構(gòu)建更加粗壯、高密和龐大根系組織，以抵御冬天寒冷[5,27]。初花期是植物從營養(yǎng)生長進入生殖生長轉(zhuǎn)折時期，多年生和一年生蕎麥根系在這一時期出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，恰好印證上述結(jié)論。

相關(guān)分析將10個指標分成3種類型，第一類包含IAA、GA、GR等3個指標，第二類包含CAT、CTK、POD、GST、APX等5個指標，第三類包含SOD和GPX等2個指標。第一類指標和第二類指標存在顯著負相關(guān)，主要表現(xiàn)為：第一類指標如IAA和GA含量在多年生蕎麥根發(fā)育過程中高于一年生蕎麥根，第二類指標如POD、GST和APX活性在多年生蕎麥根發(fā)育過程中均低于一年生蕎麥根。本文明確多年生蕎麥和一年生蕎麥在不同發(fā)育期內(nèi)源激素和7個酶活指標動態(tài)變化關(guān)系及其差異關(guān)鍵時期，為從生理水平探討多年生和一年生作物根系差異提供參考。