高甲基化CD36基因?qū)夏曛型砥诜伟┗颊卟∏檫M(jìn)展的影響

江山 李輝 鄧智霞 謝寒丹 藍(lán)楠

肺癌是死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病的原因有多種，其中最危險的因素是吸煙，吸煙量與肺癌之間存在著明顯的量-效關(guān)系，被動吸煙或環(huán)境吸煙也是肺癌的病因之一；工業(yè)生產(chǎn)中接觸與肺癌發(fā)病有關(guān)的特殊物質(zhì)，如石棉、煤焦油、煙草的加熱產(chǎn)物及鈾、鐳等放射性物質(zhì)衰變時產(chǎn)生的電離輻射和微波輻射等可使肺癌的發(fā)生風(fēng)險增加[1]。與交通相關(guān)的石油、煤等燃燒后產(chǎn)生的致癌烴等有害物質(zhì)污染大氣也會促使肺癌的發(fā)生[2]。在臨床治療中，由于肺癌的癥狀具有較強的隱匿性，通常在發(fā)現(xiàn)時患者已處于病情發(fā)展的中晚期，此時及時準(zhǔn)確判斷病情十分重要。CD36是B類清道夫受體家族的成員之一，是跨膜糖蛋白的受體，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞表面都有表達(dá)，能夠與脂蛋白、絲氨酸磷脂和血小板反應(yīng)蛋白-1等配體相結(jié)合從而發(fā)揮不同的功能[3]。CD36基因甲基化表達(dá)對肺癌患者的診斷及判斷分期和預(yù)后具有一定價值。本研究對比老年中晚期肺癌患者甲基化CD36基因表達(dá)情況，探討高甲基化CD36基因?qū)夏曛型砥诜伟┗颊卟∏檫M(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇我院收治的62例老年中晚期肺癌患者，按病情進(jìn)展情況將其分為A組（Ⅲ期患者）和B組（Ⅳ期患者），每組31例。其中A組男15例，女16例，年齡55～75歲，平均（61.02±6.32）歲，腺癌11例，鱗癌14例，小細(xì)胞癌6例；B組男17例，女14例，年齡52～82歲，平均（61.56±5.64）歲，腺癌10例，鱗癌16例，小細(xì)胞癌5例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)面部頸部水腫、聲音嘶啞、胸悶氣短等癥狀；經(jīng)病理檢查確定腫瘤已處于中晚期；年齡大于50歲；臨床資料完整；同意接受本研究所涉及的相關(guān)檢查，配合研究；簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)其他惡性腫瘤；自身免疫系統(tǒng)疾病；顱內(nèi)轉(zhuǎn)移；有肝腎功能異常、凝血功能障礙。

1.4 方法CD36基因檢測：進(jìn)行初次治療前，患者均在空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行凝血功能測定后，抽取5ml血液留用，以CD36FTTC/TSPPE對全血進(jìn)行雙標(biāo)記染色， 染色基質(zhì)為2%PBS液，染色在暗環(huán)境下操作，染色結(jié)束后使用終濃度1%PFA固定待測。使用Attune NxT流式細(xì)胞儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)]進(jìn)行測定，對儀器進(jìn)行調(diào)試后，以前向角和側(cè)向角散射光形成的對數(shù)散點圖在血小板位置設(shè)定收集門，以固定條件收集樣本。每個樣品管收集104個血小板留待分析。使用Macintosh Quadra 650計算機和Cell Quest軟件對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行收集處理。設(shè)置機器測試條件為FSC電壓E00，增益1.00，對數(shù)，SSC電壓347mV，對數(shù)；FL1電壓674mV，對數(shù)；FL2電壓517mV，對數(shù)；熒光補償FL1-0.8%FL2，F(xiàn)L2-24.6% FL1；激光功率15mW，激發(fā)光波長488nm。

腫瘤標(biāo)志物檢測：兩組患者均接受常規(guī)抗腫瘤治療，于初次治療前及第1個治療周期結(jié)束后分別進(jìn)行血清檢測。在患者空腹?fàn)顟B(tài)下抽取5ml血液儲存于-80℃環(huán)境中保存待用，使用Avanti J-E多用途高效離心機（美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)），以 1 500r/min的速度對血液離心15min，離心血液時間和采血時間間隔應(yīng)不超過30min，離心結(jié)束后取上清液用全自動血液分析儀（美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)）對CYFRA 21-1、NSE、CEA進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較A組患者血小板數(shù)量和CD36基因表達(dá)量明顯低于B組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較（±s）

表1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較（±s）

組別 n 血小板數(shù) CD36表達(dá)平均熒光道數(shù)CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSP- CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSPA組 31 43.93±15.45 726.87±137.62 8762.13±534.45 35.13±15.22 197.30±95.15 201.94±51.41 B組 31 35.08±12.24 798.46±126.25 9439.73±514.96 27.80±10.06 242.15±58.88 232.90±53.34 t 2.500 2.134 5.083 2.237 2.232 2.327 P 0.015 0.037 0.000 0.029 0.029 0.023

2.2 兩組患者CD36基因甲基化情況比較A組患者CD36基因甲基化率明顯低于B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但兩組半甲基化和完全甲基化對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組患者CD36基因甲基化情況比較[n（%）]

2.3 治療前后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平及CD36基因甲基化率比較治療前及治療后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平及CD36基因甲基化率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；治療后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平及CD36基因甲基化率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 治療前后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平及CD36基因甲基化率比較

3 討論

肺癌是對人類生命造成嚴(yán)重威脅的疾病之一，具有較高的死亡率，引起肺癌的原因較多，預(yù)防難度較大，而且肺癌患者常伴有咳嗽、咯血、發(fā)熱、胸部疼痛、胸悶氣急、聲音嘶啞等癥狀，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[4]。老年肺癌患者身體機能逐漸退化，面臨多重疾病困擾，因此身體出現(xiàn)異常狀況時難以引起重視，就診時病情往往已發(fā)展至中晚期，容易對治療失去信心[5，6]。及時準(zhǔn)確判斷患者病情有利于制定針對性治療方案，樹立患者治療信心。近年來隨著環(huán)境及生活方式改變，肺癌的發(fā)病率呈較為明顯的上升趨勢，對肺癌患者的診斷主要有病理、影像學(xué)和免疫學(xué)等檢查方式，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測方法也逐漸豐富[7]。

隨著對癌癥發(fā)病機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)對癌癥病情的預(yù)測和判斷具有重要作用。中晚期腫瘤患者通常會出現(xiàn)廣泛的血小板激活，激活的血小板會使粘附分子表達(dá)和釋放的產(chǎn)物隨之增加，進(jìn)而引起血液出現(xiàn)高粘高凝狀態(tài)。血小板能夠通過癌細(xì)胞循環(huán)運輸、癌細(xì)胞隨血細(xì)胞栓子粘附在血管內(nèi)皮表面、癌細(xì)胞移出血管壁浸潤及癌細(xì)胞增殖形成轉(zhuǎn)移灶等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，血小板的激活狀態(tài)與腫瘤患者病情發(fā)展存在明顯關(guān)系[8，9]。 CD36是一種存在于多種細(xì)胞表面且能夠與多種細(xì)胞因子結(jié)合從而產(chǎn)生不同生理功能的基因，其配體有膠原蛋白、長鏈脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）、抗血管發(fā)生因子血小板反應(yīng)蛋白（TSP-1）以及氧化修飾的低密度脂蛋白。粘附于血管內(nèi)皮的CD36受體與TSP-1相結(jié)合會使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡從而起到抗血管發(fā)生的作用。其發(fā)生過程是CD36受體通過Type-1與TSP-1進(jìn)行結(jié)合，將酪氨酸蛋白激酶、P59、細(xì)胞分裂活化蛋白激酶P38依次激活，進(jìn)而促進(jìn)凋亡蛋白酶3的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡[10，11]。此外，CD36在巨噬細(xì)胞上表達(dá)會受到包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）在內(nèi)的細(xì)胞因子和過氧化物酶體增殖因子激活受體（PPAR）的調(diào)節(jié)。CD36在正常動脈壁巨噬細(xì)胞上的表達(dá)很低，當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時會呈現(xiàn)較高的表達(dá)。

基因甲基化是最早發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行深入研究的表觀遺傳調(diào)控機制之一，能夠在不改變基因序列的前提下使基因的遺傳表觀得以改變，在甲基酶的作用下使基因的染色體結(jié)構(gòu)和作用方式發(fā)生改變，從而達(dá)到控制基因表達(dá)的目的。在癌癥患者中，抑癌基因的高甲基化已成為癌癥發(fā)展的重要判斷參數(shù)，在癌癥發(fā)展進(jìn)程中，大量基因被沉默或激活使基因表達(dá)失常從而促進(jìn)癌癥發(fā)生，所以基因甲基化檢測能夠?qū)Π┌Y的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測以及對病情發(fā)展進(jìn)行判斷[12]?；蚣谆癄顟B(tài)是腫瘤發(fā)生的一種敏感指標(biāo)，當(dāng)癌細(xì)胞產(chǎn)生時會釋放DNA到外周血中，在血清和血漿中表現(xiàn)尤為富集，此外在人體腫瘤細(xì)胞累及的相關(guān)體液中也能檢測出腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化，如唾液和痰液等，這些生物樣品在收集過程中更加容易獲得，因此相較于其他腫瘤發(fā)生和發(fā)展標(biāo)志物，基因甲基化的檢測更加容易被接受且能夠提供具有價值的信息[13，14]。此外，在不同腫瘤中某一基因的甲基化區(qū)域通常是一樣的，在檢測時也更加方便，容易與正常組織中的陰性背景進(jìn)行 區(qū)分。

由于基因甲基化變化在癌癥病情發(fā)展中具有較為明顯的作用，因此對癌癥患者的治療措施也能夠以此為出發(fā)點進(jìn)行選擇，基因去甲基化的機制包括主動去甲基化和特定位點的去甲基化，基于基因甲基化的可逆性可將高甲基化基因作為癌癥治療的重要靶點，使用藥物促使其恢復(fù)表達(dá)。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者病情惡化的重要原因之一，腫瘤細(xì)胞可通過侵犯臟層胸膜、癌細(xì)胞脫落進(jìn)入胸膜腔，形成種植性轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞隨肺靜脈回流到左心后，可經(jīng)過血行轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到體內(nèi)任何部位，此外，淋巴道轉(zhuǎn)移是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑，腎臟、消化道、骨組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等也是肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的通道和途徑。因此對患者血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測能夠有效判斷患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，同時還能掌握患者病情發(fā)展?fàn)顩r。目前臨床上還未發(fā)現(xiàn)對肺癌具有特異性的標(biāo)志物，與之相關(guān)的研究較多。陳從華等[15]研究指出CYFRA 21-1、NSE、CEA與肺癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及其預(yù)后狀況存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，不同病程分期患者血清腫瘤標(biāo)志物水平有明顯差異，且治療后血清腫瘤標(biāo)志物水平下降。此外，治療前后兩組患者CD36基因甲基化率也存在明顯差異，且治療后兩組患者CD36基因甲基化率下降，說明治療對患者基因甲基化水平存在影響，提示對CD36基因甲基化表達(dá)進(jìn)行調(diào)控有望實現(xiàn)腫瘤控制。去甲基化藥物在改變基因甲基化表達(dá)的同時還能夠抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移以達(dá)到緩解病情的目的。CD36基因的表達(dá)強度也可以進(jìn)行控制，核激素受體超家族中的PPAR被認(rèn)為是對CD36進(jìn)行調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，在具有表達(dá)缺陷的巨噬細(xì)胞上原來對CD36進(jìn)行上調(diào)的激動劑在PPAR的作用下已不能再誘導(dǎo)CD36產(chǎn)生，此外，PPAR能夠與黃醇類似物X受體（RXR）結(jié)合形成異源二聚體，對脂代謝和多種蛋白的形成起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[16]。當(dāng)然，并不是所有細(xì)胞中的PPAR都對CD36具有主要調(diào)節(jié)作用，如在心肌細(xì)胞中CD36的表達(dá)就只對PPAR的激動劑產(chǎn)生反應(yīng)，在骨骼肌和心肌細(xì)胞中CD36表達(dá)的改變也與LCFA的水平存在關(guān)系。由于CD36配基的多樣性，臨床中研究相關(guān)調(diào)節(jié)藥物時需要對其是否會引發(fā)副作用進(jìn)行慎重考慮，噻唑阮二酮（TZD）類胰島素增敏藥物能夠?qū)奘杉?xì)胞上CD36的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是也會引起肝X受體（LXR）激活并增加ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體AI（ABCAI）所調(diào)節(jié)的膽固醇流出，最終可以達(dá)到相對平衡的狀態(tài)[17，18]。而他汀類藥物能夠通過抑制巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)發(fā)揮作用[19，20]。這為中晚期肺癌患者的臨床治療提供了新的方向，但是其藥物應(yīng)用的合理性和對人體的實用性還需要進(jìn)行多次實驗確定。

本研究結(jié)果顯示，Ⅲ期老年中晚期肺癌患者血小板數(shù)以及CD36基因表達(dá)量均較Ⅳ期患者低，血小板活化時TSP的分泌能夠使其局部濃度得到顯著提高，對腫瘤轉(zhuǎn)移具有明顯的促進(jìn)作用，老年中晚期肺癌患者的血小板呈現(xiàn)明顯的廣泛激活狀態(tài)，且隨著病情的發(fā)展具有明顯差異，因此CD36基因的表達(dá)對中晚期肺癌患者病情判斷具有重要作用。此外，CD36基因的高甲基化表達(dá)在老年中晚期肺癌患者的病情發(fā)展中具有明顯差異，CD36基因甲基化率較高，而Ⅳ期患者又明顯高于Ⅲ期患者。因此說明高甲基化CD36基因?qū)夏曛型砥诜伟┗颊卟∏榈陌l(fā)展具有明顯作用，且可以將其作為治療的重點靶向。兩組半甲基化和完全甲基化對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但數(shù)據(jù)存在差異，有待積累更多樣本進(jìn)行驗證。

綜上所述，CD36基因高甲基化表達(dá)對老年中晚期肺癌患者的病情發(fā)展具有明顯影響，在臨床治療中可通過探究其生理機制進(jìn)行針對性藥物研究，對CD36基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而抑制腫瘤產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而對病情起到控制作用。