三種海螵蛸的處理方法及抗菌活性研究?

朱文靜， 陳四清， 謝國駟， 李 杰， 田 蕊， 劉宇巖， 邊 力， 胡文革??

(1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 石河子 832000； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266071)

抗生素的濫用使得耐藥菌株越來越多，多種藥物對(duì)耐藥菌的療效減弱，甚至出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”[1]，在耐藥菌株大量產(chǎn)生的背景下，中藥卻因靶點(diǎn)多、來源廣等特點(diǎn)未出現(xiàn)明顯耐藥性[2]，所以近年來研究人員對(duì)大量中草藥進(jìn)行了篩選提取，以找出更多的抗菌物質(zhì)。陳勇川等[3]研究黃芩苷/黃芩素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著逆轉(zhuǎn)耐藥菌對(duì)苯唑西林的高度耐藥；胡歡等[4]對(duì)卷柏、夏枯草等36種中藥材乙醇提取物體外抗菌活性發(fā)現(xiàn)有15種草藥有廣譜抗菌性；張永剛等[5]研究18種中草藥對(duì)哈維氏弧菌抑菌活性發(fā)現(xiàn)僅兩種中草藥無抑菌性；戴碧鑫等[6]對(duì)大黃原藥材和藥渣進(jìn)行抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其簡單水提液即有抗菌性。中草藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥精華，對(duì)其進(jìn)行抗菌活性篩選有廣闊的開發(fā)前景。

海螵蛸為傳統(tǒng)中藥，又名烏賊骨，《中醫(yī)藥典》[7]把烏賊科無針烏賊(Sepiellamaindroni)或金烏賊(Sepiaesculenta)的干燥內(nèi)殼收錄為海螵蛸。海螵蛸含碳酸鈣、微量元素、氨基酸、殼聚糖等多種成分，其性咸，溫，具有生肌止血，制酸止痛，解毒消炎等功效[8-11]。近年來，學(xué)者們運(yùn)用分離成分等現(xiàn)代方法對(duì)海螵蛸的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行研究，證實(shí)其具有中和胃酸[12]、抗?jié)僛13]、成骨[14]、止血[15]等作用。雖然海螵蛸藥用范圍較廣，但在海產(chǎn)品加工中，常作為廢料處理，甚至在藥用過程中還要去掉硬殼層，造成了海螵蛸資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

目前，對(duì)海螵蛸的研究較少，且多集中在臨床治療潰瘍、止血、成骨及其各種成分應(yīng)用等，尚未有關(guān)于其抗菌活性的研究。本研究對(duì)金烏賊海螵蛸的簡單水溶物進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，待確定其具有抗菌活性后，研究幾種處理對(duì)抗菌活性的影響，最后探究金烏賊、曼氏無針烏賊和虎斑烏賊(Sepiapharaonis)三種烏賊海螵蛸對(duì)幾種人體和海洋常見致病菌的抗菌性及差異。本研究旨在豐富抗菌中藥材，為海螵蛸抗菌性的開發(fā)利用提供依據(jù)，避免海螵蛸資源浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 供試藥材 金烏賊、曼氏無針烏賊、虎斑烏賊分別采自于山東、福建、廣東沿海，解剖出內(nèi)骨后，用軟毛刷輕刷表面臟污墨跡等，用蒸餾水沖干后自然晾干。

1.1.2 供試菌株 試驗(yàn)用菌包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)，其中前五株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所病研室提供，后三株為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.3 試劑 2216E瓊脂、2216E液體培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂、沙氏葡萄糖肉湯均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，牛肉膏蛋白胨肉湯購自索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原材料處理 三種海螵蛸經(jīng)粉碎過50目篩，在烘箱低溫(60 ℃)烘干至恒重，裝于50 mL離心管放干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥液原液制備 預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金烏賊海螵蛸對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果明顯，因此通過選用金烏賊海螵蛸不同處理方法藥液對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性的比較，研究確定三種海螵蛸的藥液原液制備方法，具體方法如下(每種方法重復(fù)3個(gè)平板)：

步驟A：海螵蛸粉末的初步處理(見表1)。

表1 金烏賊海螵蛸處理方法Table 1 Treatment of cuttlebone

步驟B：海螵蛸的溶劑選擇：稱取海螵蛸2 g，分別加滅菌蒸餾水、滅菌0.9% NaCl 溶液、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇至10 mL，用A確定的最佳方法處理后檢測抗菌效果，選擇抗菌效果最好的溶劑作為最佳溶劑。

步驟C：海螵蛸固液比的確定：分別稱取5.00、3.35、2.50、2.00、1.65 g海螵蛸粉末于離心管，補(bǔ)足B確定的最佳溶劑至10 mL，用A確定的最佳方法處理后檢測抗菌效果，得到最佳固液比。

步驟D：海螵蛸粉末的浸泡時(shí)間：用A確定的最佳方法處理、B確定的最佳溶劑、C確定的最適固液比分別在實(shí)驗(yàn)4、6、8、12、24、36 h檢測抗菌效果。

確定好最佳處理方法后，分別稱取三種海螵蛸粉末20 g，按上述篩選的最佳方法處理后，用旋蒸儀在60 ℃以下減壓濃縮成1 g/mL的浸液，經(jīng)過0.22 μm濾膜濾過后放在抗生素藥敏瓶中備用。

1.2.3 藥敏紙片制備 用打孔器對(duì)干凈且吸水性較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)定性濾紙打孔成6 mm 的圓形的濾紙片，并置于潔凈干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，在 121 ℃的條件下高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后置于生物安全柜內(nèi)備用。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，每個(gè)濾紙片加10 μL 1 g/mL的浸液。

1.2.4 微生物培養(yǎng)活化及菌懸液制備 制備牛肉膏蛋白質(zhì)肉湯、沙氏肉湯、2216E液體培養(yǎng)基、2216E瓊脂和Mueller-Hinton瓊脂，121 ℃滅菌15 min，瓊脂冷卻后在無菌環(huán)境倒入培養(yǎng)皿。在生物安全柜內(nèi)，將供試菌株用接種環(huán)接種在其對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃搖床恒溫培養(yǎng)18 h，用0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艽_定菌液濃度后稀釋至107～108CFU/mL 備后續(xù)的藥敏紙片抑菌實(shí)驗(yàn)用，105～106CFU/mL備后續(xù)的最小抑菌濃度使用。

1.2.5 海螵蛸對(duì)受試菌株的抑菌作用 在生物安全柜中，每個(gè)平板加100 μL 細(xì)菌肉湯(每個(gè)菌種都接種于Mueller-Hinton平板，溶藻弧菌和哈氏弧菌另接入2216E固體平板)，用涂布棒涂板后放上加藥液的濾紙片，設(shè)置四環(huán)素藥敏片作陽性對(duì)照組，陽性對(duì)照試驗(yàn)一次，三種海螵蛸藥液在每種平板上均重復(fù)3次測定。

將處理好的細(xì)菌平板于 28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，到培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后取出，觀察菌落的生長情況，采用十字交叉方法測量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)，每組重復(fù)3次，取平均值，抑菌圈直徑>20 mm為極敏，直徑在15～20 mm之間為高敏；直徑在10～14 mm之間為中敏；直徑<10 mm為低敏；直徑<8 mm為無抗菌性[16-18]。最后計(jì)算的平均值轉(zhuǎn)換為抑菌率評(píng)價(jià)抑菌效果。實(shí)驗(yàn)中將抑菌率作為評(píng)價(jià)抗菌效果的指標(biāo)，抑菌率的計(jì)算公式如下：

1.2.6 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法測定MIC(Minimum inhibitory concentration)，均按照CLSI 2012版指南進(jìn)行[19](細(xì)菌用MH肉湯培養(yǎng)液，真菌用液體沙氏培養(yǎng)基)。按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL作為陰性對(duì)照。96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，吸取每個(gè)不同濃度梯度的藥液接種于普通培養(yǎng)基上，每種藥物3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。肉眼觀察藥物最低濃度無細(xì)菌生長，即為該藥的MIC。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

處理方法所得結(jié)果用Excel進(jìn)行平均值計(jì)算并作圖；藥敏結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海螵蛸的處理方法

2.1.1 滅菌方法 據(jù)表1不同方法滅菌處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見表2。

表2 海螵蛸滅菌方法對(duì)抑菌活性的影響Table 2 Effect of cuttlebone sterilization on antibacterial activity

從表2可知，A0雖有抑菌效果，但藥敏紙片周圍有一圈紅色菌落，A1、A2、A3無抑菌效果，A4、A5有效果，A5效果最好。A0粉末未滅菌，自身可能帶有未知菌，因此藥敏紙片周圍會(huì)有一圈菌。

2.1.2 溶劑種類 據(jù)1.2.2步驟B不同溶劑處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見表3。

表3 溶劑對(duì)抑菌效果的影響Table 3 Effect of solvent on antibacterial activity

表3抗菌圈大小結(jié)果顯示，五種溶劑對(duì)海螵蛸藥液抗菌效果的影響是80%乙醇>60%乙醇>無水乙醇>蒸餾水=0.9% NaCl 溶液，80%乙醇處理效果最好。

2.1.3 固液比 據(jù)1.2.2步驟C不同固液比處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見圖1。

圖1 固液比對(duì)抑菌活性的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial activity

從圖1可以看出，隨海螵蛸粉末比例的降低，藥液抗菌效果先上升后下降，固液比1∶4時(shí)抗菌效果最好。

2.1.4 浸泡時(shí)間 據(jù)1.2.2步驟D不同時(shí)間處理的金烏賊海螵蛸粉末藥液抑菌效果見圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響Fig.2 Effect of time on bacteriostatic activity

從圖2可知，隨浸泡時(shí)間的延長，海螵蛸藥液抗菌效果先快速增強(qiáng)，在6 h時(shí)達(dá)到最大，隨著浸泡時(shí)間的增長，藥液抗菌效果逐漸下降。

2.2 海螵蛸對(duì)受試菌株的抑菌作用

稱三種海螵蛸粉末各20 g，依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按固液比1∶4加入80%酒精于錐形瓶中， 80 W超聲波3次，60 ℃，每次20 min，震蕩混合6 h，用旋蒸儀在60 ℃以下減壓濃縮去酒精成1 g/mL的浸液，0.22 μm濾膜過濾。為防止酒精殘留的影響，增加一個(gè)80%酒精對(duì)照組，100 mL 80%酒精同樣在旋蒸儀旋蒸。在涂布過菌的平板上加上濾紙片，每個(gè)濾紙片加10 μL藥液，每種菌重復(fù)3個(gè)板，結(jié)果見表4。

表4 三種海螵蛸對(duì)8株受試菌的抑菌效果Table 4 Inhibition zones of three cuttlebone against 8 tested strains

由表4可知，三種海螵蛸對(duì)銅綠假單胞菌、副溶血弧菌和白色念珠菌均無抑制作用；對(duì)金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌和哈氏弧菌均有抑制作用，以金烏賊海螵蛸抑制哈氏弧菌效果最好，抑菌圈、抑菌率最大(12.23 mm、103%)；金烏賊和曼氏無針烏賊對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有抑制作用，虎斑烏賊無抑制作用。

2.3 最小抑菌濃度

測定最小抑菌濃度時(shí)，為了防止酒精殘留對(duì)菌的影響，同時(shí)設(shè)置同條件處理的80%酒精對(duì)照管。根據(jù)表4結(jié)果，選取抑菌率>50%的菌種進(jìn)行最小抑菌濃度的測定，測定結(jié)果如表5所示。

表5結(jié)果顯示，金烏賊海螵蛸和曼氏無針烏賊對(duì)枯草芽孢桿菌MIC>125 mg/mL，抑制效果較弱，虎斑烏賊無抑制效果；對(duì)金黃色葡萄球菌金烏賊海螵蛸和曼氏無針烏賊MIC為31.25 mg/mL，有一定抑制效果，虎斑烏賊MIC>125 mg/mL，抑制較弱；對(duì)海洋常見的菌哈氏弧菌和溶藻弧菌金烏賊、曼氏無針烏賊MIC分別為3.9、15.6 mg/mL，虎斑烏賊分別為15.6、31.25 mg/mL，說明金烏賊、曼氏無針烏賊抑制效果好，虎斑烏賊有一定抑制效果。

表5 三種海螵蛸對(duì)受試菌的MIC測定Table 5 MIC determination of three cuttlebone against tested strains /(mg·mL-1)

3 討論

3.1 海螵蛸處理方法的比較

海螵蛸是傳統(tǒng)的中藥，具有消炎、制酸止痛作用。不同的處理方法會(huì)使海螵蛸抗菌活性發(fā)生變化，本研究結(jié)果表明，中藥常用的水煮法獲得的海螵蛸粉末水煮液對(duì)細(xì)菌無效，粉末紫外、高壓處理的也無效，可能是因?yàn)楦邷?、紫外破壞海螵蛸?nèi)對(duì)抗菌有效的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)合范薏淇等[11]綜述海螵蛸成分含有殼聚糖，殼聚糖多由天然甲殼類動(dòng)物外骨骼和藻類中提取，具有廣譜抗菌活性[20-22]，超聲波處理組藥液效果最好，可能原因是殼聚糖不易溶于水，超聲波具有滅菌作用，可以幫助部分殼聚糖溶解而不破壞分子結(jié)構(gòu)，因此，用超聲波處理加滅菌蒸餾水的海螵蛸粉末獲得藥液為最佳滅菌方法。

(①金烏賊Sepia esculenta；②曼氏無針烏賊Sepiella maindroni；③虎斑烏賊Sepia pharaonis.)圖3 海螵蛸對(duì)各種細(xì)菌的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of cuttlebone against various bacteria

海螵蛸在治療潰瘍創(chuàng)傷時(shí)，民間使用方法多是直接撒于創(chuàng)傷處，但直接用海螵蛸粉末測定抗菌活性不便操作，因此試驗(yàn)采用浸泡提取藥液進(jìn)行。根據(jù)湯嘉文[23]論述的中藥抗菌機(jī)制，并結(jié)合李蘭等[24]發(fā)現(xiàn)的海螵蛸主要成分為碳酸鈣，還含有一些其它金屬離子，推測海螵蛸的抗菌作用機(jī)制可能是破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因海螵蛸碳酸鈣含量高，在80%乙醇溶液中會(huì)有部分Ca2+水解出，帶正電荷的Ca2+會(huì)和帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電作用，改變和破壞細(xì)菌表面膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[25]，而有些成分，如氨基酸、多糖脂溶性較好，因此純水、純乙醇均沒有80%酒精抑菌效果好。付若秋等[26]研究牡丹皮體外抗菌效果發(fā)現(xiàn)的水提取物強(qiáng)于乙醇提取物，可能與牡丹皮水溶性的抗菌物質(zhì)為主有關(guān)，胡歡[4]對(duì)36種中藥抗菌活性研究時(shí)所用溶劑與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，說明80%乙醇是海螵蛸的理想提取劑。

唐麗娟等[27]研究海螵蛸多糖的最佳提取條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)固液比對(duì)多糖的提取有影響，推測海螵蛸提取液藥效也會(huì)受到固液比影響，本實(shí)驗(yàn)海螵蛸與80%乙醇不同固液比的抗菌效果表明固液比1∶4時(shí)抗菌圈直徑最大，效果最好，這一結(jié)果與唐麗娟的研究結(jié)果一致，即固液比影響海螵蛸提取液的藥效，固液比1∶4效果最好。

每種中藥的浸泡提取時(shí)間都有一定要求，依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，金烏賊海螵蛸粉末在不同浸泡時(shí)間處理下，4～6 h 藥液抗菌圈增大，6 h后藥液抗菌圈逐漸減小，浸泡6 h的藥液抗菌圈最大。分析原因可能是在6 h前，海螵蛸有效成分未能充分浸泡溶解，6 h左右溶解最好，隨著時(shí)間延長，溶解的有效成分在溶液中可能發(fā)生反應(yīng)或變化，從而使藥效減弱。

3.2 海螵蛸抗菌活性的比較

海螵蛸具有治療沙眼[28]、潰爛期褥瘡[29]的功效，沙眼和潰爛期褥瘡會(huì)面臨感染細(xì)菌的危險(xiǎn)，而用海螵蛸則可治療，說明海螵蛸具有抗菌作用，表4中對(duì)8株受試菌的抑菌實(shí)驗(yàn)藥敏性分析顯示，對(duì)金烏賊和曼氏無針烏賊海螵蛸金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表現(xiàn)為中敏，枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為低敏，大腸桿菌雖然有抑菌圈，但直徑較小，表現(xiàn)為不敏感；對(duì)虎斑烏賊海螵蛸金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表現(xiàn)為低敏。

實(shí)驗(yàn)中，80%酒精對(duì)照組菌落生長均不受影響，而加藥組菌株生長受到明顯抑制，可以排除80%酒精殘留的影響，說明利用80%酒精幫助提取海螵蛸藥液是可行。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海螵蛸在2216E培養(yǎng)基上，對(duì)哈氏弧菌和溶藻弧菌有抑菌效果，在MH培養(yǎng)基上，幾乎無抑菌效果現(xiàn)象，這說明海螵蛸的藥效會(huì)受到環(huán)境因子的影響，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

顧青青等[30]對(duì)不同產(chǎn)地的海螵蛸核苷類成分測定中發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)核苷類成分差異較大，這一結(jié)果與本研究的三種海螵蛸效果不同有相似之處。顧青青采集的不同產(chǎn)地海螵蛸，來自福建、山東、海南等地，由于沒有進(jìn)行種類鑒定，有可能是不同品種烏賊的海螵蛸，造成成分差異，這也是造成藥效差異的一個(gè)重要因素。為此推測海螵蛸的藥效與種類、產(chǎn)地密切相關(guān)。

另外綜合比較抑菌圈與MIC發(fā)現(xiàn)，金烏賊和曼氏無針烏賊的海螵蛸藥液抑菌效果明顯強(qiáng)于虎斑烏賊，與《中國藥典》中僅把前兩種認(rèn)定為海螵蛸一致。而不把虎斑烏賊列為海螵蛸，除了抗菌效果沒有金烏賊和曼氏無針烏賊明顯外，其資源不足也是一大原因。董正之[31]曾對(duì)中國近海頭足類分布狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，黃海區(qū)域占優(yōu)勢的物種是金烏賊、東海區(qū)域占優(yōu)勢的物種是曼氏無針烏賊，而虎斑烏賊則主要分布在西北太平洋和北印度洋等熱帶海域沿海[32-34]。同時(shí)，金烏賊作為世界烏賊科中重要的經(jīng)濟(jì)種類之一，年產(chǎn)量在世界烏賊科種類中居第二位[35]，其捕撈量遠(yuǎn)超虎斑烏賊，因而得到的內(nèi)殼量也多。

綜上所述，影響海螵蛸抗菌活性的因素較多，產(chǎn)地、提取方法等都會(huì)有影響，而部分中藥常有“體外無效，經(jīng)體內(nèi)代謝后起效”的現(xiàn)象，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)也可能會(huì)有很大差距，因此后續(xù)試驗(yàn)可以嘗試進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。目前對(duì)中藥抗菌性的應(yīng)用多聯(lián)合西藥[3,36]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海螵蛸抗菌效果較抗生素差，正式應(yīng)用時(shí)可與其它藥物聯(lián)合。另外，雖然虎斑烏賊海螵蛸抑菌活性差，但其規(guī)格比金烏賊和曼氏無針烏賊大，在南海有較大的產(chǎn)量，因此作為海產(chǎn)品加工中的副產(chǎn)品，也應(yīng)該進(jìn)一步研究其藥理功能，充分發(fā)揮海洋資源作用。