文昌魚Gcm2-like基因的進化與表達?

王云生， 林鵬燕， 徐高倩， 劉振輝

(中國海洋大學海洋生命學院 海洋生物多樣性與進化研究所， 山東 青島266003)

Gcm(Glialcellsmissing)基因首先于果蠅中被鑒定出來，其編碼一段含Gcm-motif的轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元前體細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。目前，哺乳動物同源的Gcm也已經(jīng)被分離鑒定出來[4-8]，它們都擁有高度保守的可結(jié)合DNA的Gcm-motif[4]。哺乳動物的Gcm同源基因分為Gcm1和Gcm2兩種類型，主要是在非神經(jīng)組織中表達，功能多樣[6-8]。例如：小鼠和人的Gcm1基因在胎盤中表達，參與胎盤中尿囊絨膜的形成[8-10]；然而，Gcm1基因缺失的小鼠腦中星型膠質(zhì)細胞數(shù)量并沒有明顯的減少[11]，表明Gcm1的功能在小鼠與果蠅中可能存在差異。小鼠的Gcm2基因表達在第三咽囊和源自于第三咽囊的甲狀旁腺[6,12]，參與甲狀旁腺的形成[13]；人GCM2基因純合缺失可抑制甲狀旁腺的正常形成及其功能[14]。相似地，雞中的Gcm2基因也主要表達于咽囊和甲狀旁腺[15]。

不同于陸生脊椎動物，魚類沒有甲狀旁腺，但仍有Gcm2基因的表達。以硬骨魚斑馬魚為例，Gcm2基因在咽上皮、咽囊 (Pharyngeal pouches)、鰓絲和內(nèi)鰓芽蕾(Internal gill buds)中高表達，是斑馬魚咽軟骨、鰓絲及內(nèi)鰓芽蕾形成所必需的[16-17]。相似地，軟骨魚狗鯊(Dogfish)的Gcm2基因也在咽囊及由該結(jié)構(gòu)派生出的內(nèi)鰓芽蕾中表達[15]。Gcm2作為哺乳動物甲狀旁腺發(fā)育的標記基因，卻在魚類的鰓相關(guān)結(jié)構(gòu)中高表達，暗示哺乳動物的甲狀旁腺在進化上可能來源于魚類的鰓[15]。另外，還發(fā)現(xiàn)Gcm2基因在斑馬魚的巨噬細胞中也有表達[16]。Gcm2在斑馬魚胞外鈣離子平衡的調(diào)控中也發(fā)揮重要的作用[15,18-20]。

以上這些研究表明，不同物種的Gcm基因很可能具有不同的生物學功能。頭索動物文昌魚是無脊椎動物進化到脊椎動物過程中的一個重要過渡類群，是研究脊椎動物起源與演化的理想的模式生物。本文通過生物信息學方法從文昌魚基因組鑒定出Gcm同源基因(本文命名為Gcm2-like)，分析了Gcm基因的系統(tǒng)進化，并利用RT-PCR和原位雜交技術(shù)對Gcm2-like基因在文昌魚中的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其在文昌魚的鰓中高表達，為深入研究Gcm生物學功能與進化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

青島文昌魚(Branchiostomajaponicum，曾用名B.belcheritsingtauense)，在中國青島市沙子口海域采集獲取。在實驗室每天以單細胞藻類喂食2次。在實驗開始前，將其在消過毒的過濾海水中進行2 d的絕食，以去除腸道內(nèi)的所有食物。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA第一鏈合成 使用OMEGA公司RNA提取試劑盒提取青島文昌魚不同組織的總RNA，通過Nanodrop儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質(zhì)量。使用Takara公司cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取各組織cDNA，通過β-actin檢測得到的cDNA 質(zhì)量。β-actin上下游引物為：

F：5′-TCTGGCATCATACCTTCTACAA-3′，R：5′- TCTGTGTCATCTTTTCCCTGTT-3′。

1.2.2 文昌魚Gcm2-like基因的獲取 從NCBI和Ensembl網(wǎng)站獲取斑馬魚、小鼠和人等物種的Gcm氨基酸序列，選擇白氏文昌魚或弗羅里達文昌魚數(shù)據(jù)庫，通過NCBI-BLAST-protein blast，找到文昌魚的Gcm2-like蛋白的氨基酸序列，并進行反向BLAST確認。利用primer premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，以上述反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列為：

F：5’-AGGGACTGGGACATCAACGA-3’，R：5’-GGTCGTGCGTCCCTTTGG-3’；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 7 min；4 ℃ 長期保存。將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-TE載體并轉(zhuǎn)化至DH5α中，對得到的陽性克隆菌進行測序，將測序結(jié)果與白氏文昌魚基因組數(shù)據(jù)進行對比分析。

1.2.3Gcm2-like基因序列、結(jié)構(gòu)比較和系統(tǒng)進化分析 對從NCBI中獲取的代表物種Gcm序列的基因結(jié)構(gòu)(外顯子、內(nèi)含子)進行對比，分析Gcm基因在進化過程中的保守性。用從NCBI和Ensembl網(wǎng)站獲取的其他物種的Gcm氨基酸序列，同文昌魚的Gcm2-like氨基酸序列用MegAlign軟件進行對比分析。通過Swiss-Model在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)對Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。用Sequence Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/)和Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org)對代表物種的Gcm的同源基因在染色體上的位置進行比較。同時，截取代表物種Gcm蛋白的Gcm-motif區(qū)域同文昌魚的Gcm2-like的Gcm-motif結(jié)構(gòu)域氨基酸序列用ClustalX軟件進行對比分析。通過MEGA7軟件，對不同物種的Gcm蛋白氨基酸序列用Muscle法進行比對，對比完成后進行1 000次bootstrap，分別利用平均連接聚類法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean，UPGMA)、鄰位相接法(Neighbor Joining，NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood，ML)建立關(guān)于Gcm蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 RT-PCR 利用RT-PCR檢測文昌魚Gcm2-like基因在各組織中的表達情況。本實驗中，內(nèi)參基因為ef1α基因，引物序列為：F：5′-TGCTGATTGTGGCTGCTGGTGGTACTG -3′，R：5′-GGTGTAGGCCAGCAGGGCGTG-3′。 PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 7 min；4 ℃長期保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下拍照觀察。

1.2.5 原位雜交 根據(jù)擴增得到的青島文昌魚Gcm2-like基因序列設(shè)計探針，引物序列為：

F：5’-AGGGACTGGGACATCAACGA-3’，R：5’-GGTCGTGCGTCCCTTTGG-3’。SP6和T7啟動子序列分別加在正向引物和反向引物的5’端。以青島文昌魚cDNA為模板，用合成探針時所用的引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、測序后，以測序正確的質(zhì)粒為模板，使用Roche公司DIG RNA Labeling kit試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得Gcm DIG標記的RNA正義和反義探針。使用Nanodrop儀檢測探針的濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測探針的質(zhì)量。將文昌魚組織從多聚甲醛溶液(PFA)中取出后，在石蠟切片機中固定，進行切片，切片厚度為8 μm。展片、撈片、烘片具體操作按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 Gcm基因在文昌魚及各物種中的鑒定和結(jié)構(gòu)比較

通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Gcm基因有2種類型Gcm1和Gcm2。Gcm1基因僅在從兩棲類(比如爪蟾)到哺乳動物(比如人)的物種中存在，而Gcm2(或Gcm2-like)基因廣泛存在于從海葵等低等無脊椎動物到哺乳動物的各物種中(見表1)。值得注意的是，節(jié)肢動物的黑腹果蠅、鋸齒果蠅等昆蟲存在2個Gcm基因(本文分別稱為Gcm2a-like和Gcm2b-like)。它們在染色體上位置相近，而在同是節(jié)肢動物的跳蟻、金刻沃氏蟻和家蠶等僅有一個Gcm2-like基因，因此，果蠅的這2個Gcm2-like基因可能是在果蠅的進化過程中由一個Gcm2-like基因的通過復制產(chǎn)生的。

表1 在不同物種中鑒定到的Gcm基因Table 1 Gcm genes identified in different species

研究還發(fā)現(xiàn)，綠頭鴨Gcm2基因有3個不同長度的mRNA剪接體(isoform1-3)，其中剪接體isoform1和isoform2編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列僅在N端存在差異，剪接體isoform3編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為isoform1和isoform2剪接體編碼蛋白質(zhì)的一部分。這種一個Gcm基因有多個mRNA剪接體的現(xiàn)象在無脊椎動物中更為常見，比如，星狀海葵存在6個不同的mRNA剪接體，編碼3個僅在N端有部分差異的蛋白；萼柱珊瑚存在2個不同的mRNA剪接體，編碼1個相同的蛋白；棘冠海星存在4個不同的mRNA剪接體，編碼1個相同的蛋白；而弗羅里達文昌魚有6個不同長度的mRNA剪接體(isoform 1-6)，這6個轉(zhuǎn)錄本僅在5′端存在差異，其它大部分序列都相同。這6個轉(zhuǎn)錄本編碼6個蛋白，它們的氨基酸序列僅有少數(shù)氨基酸不同，其中剪切體isoform 4, isoform5，isoform6編碼的蛋白序列完全一樣，剪切體isoform1編碼的蛋白序列僅比isoform2編碼的蛋白多1個氨基酸殘基。

通過對人、小鼠、弗羅里達文昌魚等代表物種Gcm的基因的結(jié)構(gòu)進行比較(見圖1)，我們發(fā)現(xiàn)脊椎動物Gcm1和Gcm2基因結(jié)構(gòu)在進化上較為保守，均含有2個長度分別為253和113 bp的外顯子；但有一個明顯不同，即Gcm1基因都有1個長度為129 bp的外顯子，而在Gcm2基因中其對應(yīng)的外顯子的長度為126 bp。弗羅里達文昌魚Gcm2-like基因外顯子數(shù)量較脊椎動物多1～2個，且大多數(shù)外顯子略長一些，但整體上保持了與脊椎動物的Gcm基因結(jié)構(gòu)的相似性。

(弗羅里達文昌魚Gcm2-like基因與人、小鼠、原雞、爪蟾、斑馬魚Gcm基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。序列來源參見表1。黑色方框代表編碼的外顯子，白色方框代表不編碼的外顯子，直線代表內(nèi)含子。The exon and intron structure analysis of B. floridae Gcm2-like gene and Gcm genes of human, mouse, chicken, xenopus, and zebrafish. See Table 1 for the sequence sources. The black boxes represent encoded exons, the white boxes represent unencoded exons, and the straight lines represent introns.)圖1 弗羅里達文昌魚Gcm2-like基因與其它代表物種Gcm基因的結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structural analysis of B. floridae Gcm2-like gene and Gcm genes of other representative species

2.2 Gcm基因的序列、結(jié)構(gòu)及同線性進化分析

2.2.1 Gcm-motif結(jié)構(gòu)域進化分析 Gcm-motif結(jié)構(gòu)域為Gcm蛋白的典型結(jié)構(gòu)標記，我們從不同門類中選取了幾個代表物種首先對該結(jié)構(gòu)域進行了序列相似性分析，結(jié)果顯示它們都有典型的Gcm-motif結(jié)構(gòu)特點，特別是其半胱氨酸在進化過程中十分保守(見圖2)。

黑腹果蠅、鋸齒果蠅等蠅類存在的兩種Gcm蛋白的Gcm-motif相似度為71.2%，這兩種Gcm蛋白的Gcm-motif與脊椎動物Gcm2-motif結(jié)構(gòu)域部分相似度為63.6%～67.4%，而與脊椎動物Gcm1-motif結(jié)構(gòu)域部分相似度為57.6%～62.5%(見圖2A)。同樣的，白氏文昌魚Gcm蛋白與脊椎動物Gcm2-motif結(jié)構(gòu)域部分相似性要比與脊椎動物Gcm1-motif結(jié)構(gòu)域部分的相似性略高(見圖2B)，但相差并不很大。

(A：白氏文昌魚Gcm2-like-motif結(jié)構(gòu)域與其它物種Gcm-motif的氨基酸序列用MegAlign軟件進行相似性分析。序列來源參見表1。B:人、果蠅、白氏文昌魚Gcm-motif結(jié)構(gòu)域序列用ClustalX進行對比分析，保守的氨基酸用#標注。A: Similarity analysis of amino acid sequences between the Gcm2-like motif domain of B. belcheri and Gcm-motif of other species was conducted by MegAlign software. See Table 1 for the sequence sources. B: The Gcm-motif domain sequences of human, Drosophila melanogaster and B. belcheri were contrastively analyzed by ClustalX, and the conserved amino acids were labeled with #.)圖2 白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的motif結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比較Fig. 2 Comparison of the amino acid sequence of the motif domain of B. belcheri Gcm2-like protein and Gcm protein of other species

2.2.2 Gcm的蛋白全長序列比對、結(jié)構(gòu)比較及基因在染色體上的同線性分析 將白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與代表性物種人、小鼠、原雞、果蠅等Gcm蛋白的全長序列進行對比分析，結(jié)果顯示它們的序列相似度并不高(<30%)。其中白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與人、小鼠Gcm1蛋白的相似性為26.2%～29.0%，與人、小鼠Gcm2蛋白的相似性為25.1%～27.0%(見圖3A)，顯示白氏文昌魚Gcm2-like并不特別類似Gcm1或Gcm2。

對人Gcm1、Gcm2蛋白與白氏文昌魚的Gcm2-like蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們的三維結(jié)構(gòu)都十分相似，其α螺旋和β折疊的數(shù)目均相同(見圖3B)，說明雖然Gcm蛋白序列在進化過程中發(fā)生了較大的變化，但其仍然保留了較高的三維結(jié)構(gòu)相似性，這可能對維持其功能的保守性具有重要意義。

另外，對脊椎動物染色體上Gcm位點周圍基因的分析發(fā)現(xiàn)，表1中列出的所有脊椎動物的Gcm1基因位于Cilk1、Fbxo9、Elovl5基因之間，Gcm2基因位于Mak、Sycp2l、Elovl2基因之間(見圖3C)。這些基因位于染色體的相同位置，且順序、方向一致，表明在脊椎動物的進化過程中，Gcm基因在染色體上表現(xiàn)出了很好的同線性。類似地，我們發(fā)現(xiàn)，白氏文昌魚Gcm2-like基因在染色體上與sycp2l-like基因位置相臨，這與脊椎動物Gcm2基因在染色體上的位置關(guān)系相似(見圖3C)，暗示文昌魚Gcm2-like為哺乳動物Gcm2的直系同源基因，而Gcm1基因可能是在進化過程中由Gcm2基因復制而來。

(A：白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的氨基酸序列相似性分析。代表物種Gcm全長蛋白的氨基酸序列用MegAlign軟件進行對比分析。序列來源參見表1；B：白氏文昌魚Gcm2-like蛋白、人的GCM1及GCM2蛋白預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)比較。通過Swiss-Model在線軟件對Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；C：用Sequence Viewer和Ensembl Genome Browser對表1列出的所有脊椎動物和白氏文昌魚的Gcm的同源基因在染色體上的位置進行比較。方框代表基因，箭頭代表轉(zhuǎn)錄方向。A: Amino acid sequence similarity analysis of Gcm2-like protein of B. belcheri and Gcm protein of other species. The amino acid sequences representing the full-length Gcm protein of the species were analyzed by MegAlign software. See Table 1 for sequence sources; B: Three-dimensional structural comparison of predicted Gcm2-like proteins in B. belcheri, human Gcm1 and Gcm2 proteins. The 3D structure of Gcm protein was predicted by Swiss-Model online software. C: Sequence Viewer and Ensembl Genome Browser were used to compare the locations of homologous genes in Gcm of all vertebrates and amphioxus listed in Table 1 on chromosomes. The boxes represent genes and the arrows represent transcription directions.)圖3 白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)比較，以及基因在染色體上的同線性分析Fig. 3 Comparison of the amino acid sequence and three-dimensional structure of B. belcheri Gcm2-like protein and Gcm protein of other species, as well as the analysis of synonymy of genes on chromosomes

2.3 Gcm基因的系統(tǒng)進化分析

為了進一步揭示Gcm基因的進化，本文作者基于Gcm-motif結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，利用UPGMA法構(gòu)建包含白氏文昌魚在內(nèi)的多物種Gcm的系統(tǒng)進化樹(見圖4)，結(jié)果顯示：兩棲類、鳥類和哺乳動物的Gcm1全部聚為一類，魚類、兩棲類、鳥類和哺乳動物的Gcm2全部聚為一類，無脊椎動物的所有Gcm既不與Gcm1聚為一類，也不與Gcm2聚為一類，而是也全部單獨聚為一類(見圖4)，而且無脊椎動物的Gcm處于進化的基部。本文作者又分別用NJ法和ML法進行了進化樹的構(gòu)建，結(jié)果基本一致(圖略)。再者，作者基于Gcm蛋白的全長序列分別利用UPGMA法、NJ法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹也支持上述結(jié)果(圖略)。

(通過MEGA7軟件，對不同物種的Gcm-motif氨基酸序列用Muscle法進行比對，對比完成后進行1 000次bootstrap，利用UPGMA法建立系統(tǒng)進化樹。Gcm-motif amino acid sequences of different species were compared with MUSCLE method by MEGA7 software. After comparison, 1 000 Bootstrap was performed, and a phylogenetic tree was established by UPGMA method.)圖4 文昌魚與其他物種Gcm的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Gcm in amphioxus and other species

根據(jù)以上進化樹，作者推測無脊椎動物的Gcm可能代表了脊椎動物Gcm兩種類型(Gcm1和Gcm2)分化前的原始形式，無脊椎動物的Gcm沒有Gcm1與Gcm2的分化。再結(jié)合前面的序列相似性比較及基因在染色體上的同線性分析(文昌魚的Gcm基因與脊椎動物的Gcm2基因可能為直系同源基因)，作者認為Gcm1基因可能是在進化過程中由Gcm2復制而來，脊椎動物的Gcm2可能更多保留了Gcm原始基因的特征。因此，本文將無脊椎動物的Gcm基因全部稱為Gcm2-like。最早在刺胞動物中發(fā)現(xiàn)Gcm2-like，節(jié)肢動物昆蟲綱環(huán)裂亞目(蠅類)中雖然有兩個基因，但也都屬于Gcm2-like(本文命名為Gcm2a-like和Gcm2b-like)，魚類中有Gcm2，但未找到Gcm1，兩棲類最先產(chǎn)生Gcm1(見圖5)。

(箭頭代表進化方向，方框代表Gcm蛋白類型；昆蟲綱的環(huán)裂亞目(蠅類)有2個Gcm2-like基因，魚類Gcm1未被發(fā)現(xiàn)。The arrow represents the direction of evolution and the box represents the type of Gcm protein. There are two Gcm2-like genes in Cyclorrhapha (flies) of the class Insecta. Fish Gcm1 has not been found.)圖5 Gcm蛋白由刺胞生物進化到哺乳動物簡圖Fig.5 Diagram of the evolution of Gcm protein from cnidaria to mammalia

2.4 青島文昌魚Gcm2-like基因的表達

2.4.1 青島文昌魚Gcm2-like基因組織分布的RT-PCR檢測 以青島文昌魚組織cDNA為模板,PCR擴增Gcm2-like序列，PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST分析確定屬于文昌魚Gcm2-like。利用RT-PCR檢測Gcm2-like在文昌魚各個組織中的表達情況，結(jié)果顯示Gcm2-like在文昌魚鰓和腸中表達量最高，肌肉、精巢及脊索的表達次之，在肝盲囊和卵巢中表達量最少(見圖6)。

(1：肝盲囊；2：肌肉；3：精巢；4：卵巢；：5：脊索:6：腸；7：鰓。1: Hepatic caecum; 2: Muscles； 3: Testis; 4: Ovaries; 5: Notochord; 6: Intestine; 7: Gills.)圖6 RT-PCR檢測青島文昌魚Gcm2-like基因的組織分布Fig.6 Tissue distribution of Gcm2-like gene in B.japonicum was detected by RT-PCR

2.4.2 原位雜交技術(shù)檢測青島文昌魚Gcm2-like基因的表達 對青島文昌魚進行組織切片，原位雜交顯示Gcm2-like基因在青島文昌魚的鰓、肝盲囊、腸中表達較高，特別是在鰓中有明顯的高表達(見圖7)。

((hc:肝盲囊; m:肌肉; hg:后腸; nc:脊索; g:鰓裂，Bar=100 μm。圖A、B為正義探針原位雜交圖(陰性對照);C、D為反義探針原位雜交圖(實驗組)。hc: Hepatic caecum; m: Muscle; hg: Hind-gut; nc: Notochord; g: Gill),Bar=100 μm. A and B are in situ hybridization of the righteous probe (negative control), C and D are in situ hybridization of the antisense probe (experimental group). )圖7 青島文昌魚Gcm2-like基因的切片原位雜交Fig.7 Sectional in situ hybridization of B. japonicum Gcm2-like gene

3 討論

最早發(fā)現(xiàn)的果蠅Gcm有決定神經(jīng)元細胞與膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的功能[1-3]，而其后在哺乳動物中的研究則顯示Gcm同源基因在非神經(jīng)組織表達[8,11]，這表明脊椎動物的Gcm基因與無脊椎動物的Gcm基因很大可能具有生物學功能上的差異。文昌魚處于無脊椎動物進化至脊椎動物的過渡類型，因此，對文昌魚Gcm基因進行研究對于揭示Gcm基因的進化具有重要意義。本文通過生物信息學方法首先對Gcm基因的進化進行了分析，發(fā)現(xiàn)其全長序列在各物種中相似性不高，但其Gcm-motif具有很高的保守性，特別是其Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)十分相似。我們還通過對基因在染色體上的同線性分析，認為文昌魚Gcm2-like為脊椎動物Gcm2的直系同源基因。系統(tǒng)進化分析顯示，Gcm基因在進化中，由無脊椎動物單一的Gcm2-like基因逐步分化為脊椎動物的Gcm1和Gcm2兩種基因類型。根據(jù)目前的信息，在人、小鼠等哺乳動物及雞、爪蟾等脊椎動物中，兩種類型的Gcm基因都存在，但魚類中只存在Gcm2，沒有發(fā)現(xiàn)Gcm1，魚類的Gcm1基因有可能在進化過程中發(fā)生了丟失。

在哺乳動物中，Gcm2基因在咽囊及由此派生出的甲狀旁腺中高表達，是甲狀旁腺形成所必須的，為甲狀旁腺的標記基因[13]。在魚類中，Gcm2表達在魚類的咽囊及由咽囊派生出的內(nèi)鰓蕾中，是內(nèi)鰓蕾正常形成所必需的[15]。由此，暗示哺乳動物的甲狀旁腺和魚類的內(nèi)鰓蕾為具有關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)，可能有一共同的進化史。本文發(fā)現(xiàn)，Gcm2-like基因在文昌魚的肝盲囊、腸、鰓表達較高，特別是在鰓中表達明顯，這與Gcm2基因在魚類中的表達模式相似。因此，Gcm2可能在整個脊索動物中發(fā)揮保守的功能，這也為哺乳動物的甲狀旁腺在進化上可能起源于鰓的假設(shè)提供了新的證據(jù)。

另外，我們的結(jié)果還顯示Gcm2-like基因在文昌魚的肌肉、脊索和神經(jīng)管中也有表達，盡管表達相對較低，暗示其可能還具有其它的功能，比如：魚類的鰓在鈣離子攝取中發(fā)揮著重要的作用[18-19]。關(guān)于Gcm基因的更多的生物學功能有待于進一步的研究。