分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物分析及其與番茄根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生的關(guān)系

吳鳳芝，田罡銘，白晶芝，王葉群，薛志佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱150030）

根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogynespp.）是一種威脅作物生長(zhǎng)的病原物，在世界范圍內(nèi)危害巨大[1]。在設(shè)施栽培條件下，根結(jié)線蟲(chóng)易侵染番茄根系并繁殖，對(duì)番茄根部造成大面積破壞性損傷，導(dǎo)致番茄產(chǎn)量下降，情況較重者可減產(chǎn)50%以上，甚至絕產(chǎn)[2]。在根結(jié)線蟲(chóng)影響下，番茄抗逆抗病性變差，易出現(xiàn)枯萎病、根腐病等其他病害，形成復(fù)合病害，是影響番茄生產(chǎn)一大難題[3]。

傳統(tǒng)上防治根結(jié)線蟲(chóng)主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥增加生產(chǎn)成本，消費(fèi)群體也普遍不認(rèn)可[4]。隨著人們對(duì)食品安全與生態(tài)環(huán)境的日益重視和化學(xué)農(nóng)藥的不可持續(xù)性，大多數(shù)殺線蟲(chóng)劑已被限制使用，甚至退市[5]。與化學(xué)農(nóng)藥相比，生態(tài)栽培技術(shù)防治通常更有效，環(huán)境友好[6]。其主要方式為主栽作物和抗線蟲(chóng)或非線蟲(chóng)寄主作物間、混、套作。楊帆等研究表明，伴生分蘗洋蔥（Allium ce?paL.var.aggregatumG.Don）、普通白菜（Brassica campestrisssp.chinensis（L.）Makino）、薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）、茴香（Foeniculum vulgareMill.）等作物可在不影響主栽作物番茄正常生長(zhǎng)前提下使番茄根結(jié)數(shù)量和根結(jié)指數(shù)顯著下降[7]。

利用農(nóng)藝措施防治根結(jié)線蟲(chóng)病害的優(yōu)勢(shì)逐年顯現(xiàn)，借助拮抗/殺線蟲(chóng)植物避免或阻擋根結(jié)線蟲(chóng)侵染與繁殖的過(guò)程復(fù)雜，且研究報(bào)道較少。研究表明，植物分泌的類黃酮和總酚可影響根結(jié)線蟲(chóng)病害，類黃酮物質(zhì)具有驅(qū)趕線蟲(chóng)、減緩線蟲(chóng)移動(dòng)速度、扭曲線蟲(chóng)雌雄比例，甚至殺死線蟲(chóng)等作用[8]。

劉佳遙等研究表明，分蘗洋蔥鱗莖內(nèi)含有豐富的黃酮類化合物[9]，且不同分蘗洋蔥品種伴生減輕番茄根結(jié)線蟲(chóng)病效果不同[10]，因此推測(cè)分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物在抑制番茄根結(jié)線蟲(chóng)病中發(fā)揮作用。為明確分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物與番茄根結(jié)線蟲(chóng)病關(guān)系，本研究以44份分蘗洋蔥種質(zhì)資源為試材，分析其鱗莖黃酮類化合物含量與其伴生番茄減輕根結(jié)線蟲(chóng)病害間關(guān)系，以期為揭示分蘗洋蔥伴生番茄減輕根結(jié)線蟲(chóng)病機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試根結(jié)線蟲(chóng)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施蔬菜生理生態(tài)課題組保存，經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)。

供試分蘗洋蔥由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施蔬菜生理生態(tài)課題組保存，具體名稱見(jiàn)表1。

表1 分蘗洋蔥品種Table 1 Potato onion varieties

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮類化合物提取

分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物提取按照以下步驟：

①將44份分蘗洋蔥鱗莖凍干處理48 h，直至質(zhì)量守恒。②將凍干處理后分蘗洋蔥鱗莖磨成粉末狀并過(guò)篩儲(chǔ)藏備用。③利用超聲輔助法提取分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物作為待測(cè)樣品[11]。④利用甲醇溶液配制1 mg·mL-1黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液并梯度稀釋，見(jiàn)表2。

表2 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度Table 2 Dilution concentration of flavonoids standard

完成提取后根據(jù)前期試驗(yàn)[10]，將兩種抗線蟲(chóng)效果較好分蘗洋蔥品種（M14和M37）和兩種抗線蟲(chóng)效果較差分蘗洋蔥品種（M29和M46）鱗莖提取的黃酮類化合物留作后續(xù)試驗(yàn)處理根結(jié)線蟲(chóng)試材。

1.2.2 根結(jié)線蟲(chóng)死亡率測(cè)定

根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)懸浮液采用浸泡法獲得[12]。打散混勻后吸取200 μL加入24孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入3 mL不同分蘗洋蔥（M14、M29、M37和M46）鱗莖黃酮類化合物，對(duì)照組采用滅菌水代替黃酮類化合物，每處理設(shè)5次重復(fù)。處理6和12 h時(shí)鏡檢計(jì)數(shù)，采用氫氧化鈉刺激法觀察線蟲(chóng)存活情況。

1.2.3 根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化測(cè)定

運(yùn)用浸泡法配制根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵懸浮液[12]，打散混勻后吸取200 μL加入24孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入3 mL不同分蘗洋蔥（M14、M29、M37和M46）鱗莖黃酮類化合物，對(duì)照組采用滅菌水代替黃酮類化合物，每處理設(shè)5次重復(fù)。分別在3、6和9 d鏡檢計(jì)數(shù)。

蟲(chóng)卵孵化抑制率(%)=

1.2.4 根結(jié)線蟲(chóng)趨化性測(cè)定

采用平板法調(diào)查根結(jié)線蟲(chóng)趨化性[13]。如圖1所示，于Φ 9 cm培養(yǎng)皿中取3點(diǎn)，將100條J2s放入中間點(diǎn)，再將1 mL分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物分別打入另外兩個(gè)點(diǎn)。處理1 h觀察、計(jì)數(shù)。圖1中字母區(qū)域代表排斥，數(shù)字區(qū)域代表吸引，計(jì)算趨化性Cf值（1.0≤Cf≤1.5：無(wú)趨化性；Cf<1.0：排斥；Cf>1.5：吸引）。

圖1 平板試驗(yàn)Fig.1 Schematic diagram of plate test

1.2.5 黃酮類化合物的分析與含量測(cè)定

分別采用內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法定性和定量測(cè)定類黃酮樣品[14-15]。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（Analytical 4.6×250 mm，5-Micron）。待篩選流動(dòng)相及流速見(jiàn)表3，以各條件分別等度梯度洗脫，篩選比對(duì)，選出分離度較佳，峰形較好的條件。黃酮類化合物檢測(cè)波長(zhǎng)分別為257 nm（蘆?。┖?60 nm（山奈酚、槲皮素、楊梅黃酮），流速為0.8 mL·min-1，柱溫為22℃。

按照濃度梯度準(zhǔn)確吸取黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品工作液，每針進(jìn)樣10 μL，每處理重復(fù)3次，得到峰面積，分別以濃度和峰面積A為橫軸與縱軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

分別按照上述方法，于待測(cè)黃酮類化合物樣品制備后0、2、4、8、16、24 h取同一份待測(cè)樣，檢驗(yàn)待測(cè)樣24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

分別準(zhǔn)確吸取黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述方法重復(fù)測(cè)定6次，檢驗(yàn)其重復(fù)性。

在一份已知含量待測(cè)樣中加入黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，采用上述方法測(cè)定含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

得到類黃酮含量數(shù)據(jù)后，將其與黃酮類化合物處理下根結(jié)線蟲(chóng)死亡率、蟲(chóng)卵孵化抑制率、趨化性Cf值及前期試驗(yàn)獲得的番茄根結(jié)線蟲(chóng)病情指標(biāo)[10]作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類物質(zhì)種類及含量分析

2.1.1 黃酮類物質(zhì)提取條件確定

黃酮類化合物HPLC色譜圖見(jiàn)圖2。由表4可知，通過(guò)回歸方程計(jì)算結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，分蘗洋蔥鱗莖中山奈酚、槲皮素、楊梅黃酮、蘆丁4種黃酮類化合物線性關(guān)系良好。通過(guò)樣品峰面積RSD可發(fā)現(xiàn)待測(cè)樣在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積RSD可發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)重復(fù)性良好。由表5可知，本方法回收率良好。

表4 黃酮類化合物線性關(guān)系和峰面積Table 4 Linear relationship and peak area of flavonoids

表5 黃酮類化合物加標(biāo)回收率Table 5 Recovery of flavonoids by standard addition

2.1.2 分蘗洋蔥鱗莖中蘆丁含量分析

由圖3可知，各品種分蘗洋蔥鱗莖中蘆丁含量差異較大，為11.18~126.28 mg·100 g-1DW。其中M39和M51鱗莖中蘆丁含量顯著高于其他品種（P<0.05），分別為68.37和126.28 mg·100 g-1DW。M02、M13、M21、M23、M32與M33鱗莖中蘆丁含量顯著低于其他品種（P<0.05），分別為16.29、14.85、16.19、16.46 mg·100 g-1DW。

圖3 44份分蘗洋蔥鱗莖蘆丁含量Fig.3 Rutin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.3 分蘗洋蔥鱗莖中楊梅黃酮含量分析

由圖4可知，各品種分蘗洋蔥鱗莖中楊梅黃酮含量差異較大，為60.17~189.83 mg·100 g-1DW。其中M11和M14鱗莖中楊梅黃酮含量顯著高于其他品種（P<0.05），分別為181.35和189.83 mg·100 g-1DW。M40鱗莖中楊梅黃酮含量顯著低于其他品種（P<0.05），為60.17 mg·100 g-1DW。

圖4 44份分蘗洋蔥鱗莖楊梅黃酮含量Fig.4 Myricetin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.4 不同分蘗洋蔥鱗莖中槲皮素含量分析

由圖5可知，各品種分蘗洋蔥鱗莖中槲皮素含量差異較大，為464.22~1 968.14 mg·100 g-1DW。其中M11和M51鱗莖中槲皮素含量顯著高于其他品種（P<0.05），分別為1 968.14和1 902.15 mg·100 g-1DW。M38和M40鱗莖中槲皮素含量顯著低于其他品種（P<0.05），分別為512.21和464.22 mg·100 g-1DW。

圖5 44份分蘗洋蔥鱗莖槲皮素含量Fig.5 Quercetin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.5 不同分蘗洋蔥鱗莖中山奈酚含量分析

由圖6可知，各品種分蘗洋蔥鱗莖中山奈酚含量差異較大，為5.28~23.13 mg·100 g-1DW。其中M05、M12、M15與M19鱗莖中山奈酚含量顯著高于其他品種（P<0.05），分別為20.79、23.12、21.76、21.36 mg·100 g-1DW。M04、M07、M11與M31鱗莖中山奈酚含量顯著低于其他品種（P<0.05），分別為5.75、5.50、5.62、5.28 mg·100 g-1DW。

圖6 44份分蘗洋蔥鱗莖山奈酚含量Fig.6 Kaempferol contents in 44 potato onion bulbs

2.1.6 不同分蘗洋蔥鱗莖中總黃酮含量分析

由圖7可知，各品種分蘗洋蔥鱗莖中總黃酮含量差異較大，為593.22~2 204.88 mg·100 g-1DW，M11和M51鱗莖中總黃酮含量顯著高于其他品種（P<0.05），分別為2 186.59和2 204.88 mg·100 g-1DW。M38、M40與M46鱗莖中總黃酮含量顯著低于其他品種（P<0.05），分別為617.75、593.22、661.14 mg·100 g-1DW。

圖7 44份分蘗洋蔥鱗莖總黃酮含量Fig.7 Total flavonoids contents in 44 potato onion bulbs

2.2 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)死亡率的影響

由表6可知，從4種分蘗洋蔥鱗莖中提取的黃酮類化合物在處理6 h和12 h時(shí)均未對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)死亡率產(chǎn)生顯著影響。

表6 根結(jié)線蟲(chóng)死亡率Table 6 Mortality of root knot nematode

2.3 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化的影響

由表7可知，在處理12 d時(shí)，M29鱗莖中黃酮類化合物處理下根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化抑制率顯著高于對(duì)照（P<0.05），說(shuō)明分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物可抑制根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化，但需處理一定時(shí)間。

表7 根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化抑制率Table 7 Hatching inhibition rate of root knot nematode eggs

2.4 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)趨化性的影響

由表8可知，在4種分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物處理下，根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值均顯著低于對(duì)照（P<0.05），說(shuō)明分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物可影響根結(jié)線蟲(chóng)遷移。

表8 根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值Table 8 Chemotaxis Cf value of root knot nematode

2.5 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物與根結(jié)線蟲(chóng)死亡率、蟲(chóng)卵孵化率及根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值相關(guān)性分析

由表9可知，分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物含量與根結(jié)線蟲(chóng)死亡率不相關(guān)。分蘗洋蔥鱗莖中楊

表9 分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物與根結(jié)線蟲(chóng)死亡率、蟲(chóng)卵孵化率及根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值相關(guān)性分析Table 9 Correlation analysis between flavonoids in potato onion bulbs and mortality,hatchability and chemotaxis Cf value of root knot nematode

2.6 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物與根結(jié)線蟲(chóng)病相關(guān)性分析

由表10可知，蘆丁和山奈酚含量與根結(jié)線蟲(chóng)病不相關(guān)；楊梅黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)口防效呈梅黃酮、槲皮素、山奈酚、總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化抑制率均呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。分蘗洋蔥鱗莖中蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚、總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。顯著正相關(guān)（P<0.05），與根結(jié)線蟲(chóng)病情指數(shù)和番茄根結(jié)指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；槲皮素和總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病率、病情指數(shù)和番茄根結(jié)指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

表10 分蘗洋蔥鱗莖黃酮類化合物與根結(jié)線蟲(chóng)病害相關(guān)性分析Table 10 Correlation analysis between flavonoids in potato onion bulbs and root knot nematode disease

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物作為一種天然聚合物，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)有明顯影響[16]。關(guān)于植物材料中提取黃酮類化合物方法較多，利用凍干法處理植物材料可最大限度保留其中黃酮類物質(zhì)，超聲輔助法可保證提取效率[11]。因此，本試驗(yàn)采用超聲輔助法提取經(jīng)凍干處理的分蘗洋蔥鱗莖，提取率為2.608%，高效液相色譜法是植物材料黃酮類化合物最常用檢測(cè)方法，不同色譜條件效果不同[14]。本試驗(yàn)通過(guò)多種條件比對(duì)篩選出分別以甲醇和0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相A和B，流速分別為0.44和0.36 mL·min-1條件下峰型與分離情況俱佳。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素是分蘗洋蔥鱗莖中含量最多的黃酮類化合物。本研究44份分蘗洋蔥品種中，M11和M51鱗莖中黃酮類化合物含量最高，兩個(gè)品種鱗莖中槲皮素和總黃酮含量顯著高于其他品種。此外，相較于其他品種，在M11和M51鱗莖中分別含有大量楊梅黃酮和蘆丁。

本試驗(yàn)中，分蘗洋蔥鱗莖內(nèi)提取的黃酮類化合物未顯著影響根結(jié)線蟲(chóng)存活，但顯著影響線蟲(chóng)趨化性，處理12 d時(shí)M29鱗莖中類黃酮類化合物顯著提高根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化抑制率，與前期研究結(jié)果相同。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高濃度標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁處理下，顯著降低根結(jié)線蟲(chóng)存活率和蟲(chóng)卵孵化率，與Bano等研究結(jié)果一致[17]。Bano等研究表明，從植物材料中提取的黃酮類化合物受限于不同種類與濃度，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)致死率低，可顯著影響根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化和遷移性[17]。也有研究證明，山奈酚、楊梅素、槲皮素和蘆丁對(duì)線蟲(chóng)幼體具有致死作用[18]。因此，本研究得出分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物可影響根結(jié)線蟲(chóng)趨化性及根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化，但對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)無(wú)致死效果。原因可能是分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物濃度未達(dá)到殺線水平；根結(jié)線蟲(chóng)成體后對(duì)分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物抵抗能力增強(qiáng)；分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物需與其他活性物質(zhì)產(chǎn)生復(fù)合作用才可有效控制根結(jié)線蟲(chóng)病害。對(duì)分蘗洋蔥鱗莖中黃酮類化合物濃度與抑殺根結(jié)線蟲(chóng)防效關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

植物材料中提取的不同種類與濃度黃酮類化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)作用效果不同[19]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，分蘗洋蔥鱗莖中楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚、總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化抑制率均呈顯著正相關(guān)；分蘗洋蔥鱗莖中蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚、總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)趨化性Cf值均呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Wuyts等研究結(jié)果一致[8]。Wuyts等研究表明，山奈酚對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化有不利影響，山奈酚、槲皮素和楊梅黃酮對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)既有排斥作用，又有殺線蟲(chóng)作用[8]。分蘗洋蔥鱗莖中楊梅黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)口防效呈顯著正相關(guān)，與根結(jié)線蟲(chóng)病情指數(shù)和番茄根結(jié)指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)；槲皮素和總黃酮含量與根結(jié)線蟲(chóng)病情指數(shù)、發(fā)病率和番茄根結(jié)指數(shù)具有顯著負(fù)相關(guān)性，與Bar等研究結(jié)果一致[20]。說(shuō)明分蘗洋蔥鱗莖中楊梅黃酮和槲皮素可能是分蘗洋蔥伴生減輕番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的作用因子。