ROCK特異性抑制劑Y27632對缺氧后少突膠質前體細胞分化的影響

李彩紅 江 霞 喻志源 陳 雪 王 偉 駱 翔

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430030）

少突膠質前體細胞（Oligodendrocyte precursor cells，OPCs，）是上世紀80年代初發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)膠質細胞［1］，在成年CNS中占據(jù)所有膠質細胞數(shù)目的5%－8%左右。其在機體生理及病理上發(fā)揮多重作用，生理狀態(tài)下可分化為神經(jīng)元、少突膠質細胞、星形膠質細胞等不同的細胞系；參與形成髓鞘；與神經(jīng)元通過突觸發(fā)生密切聯(lián)系［2－5］。病理狀態(tài)下能夠參與形成膠質瘢痕；調控少突膠質細胞應答神經(jīng)纖維損傷，促進髓鞘再生；影響軸突生長；抑制軸突傳導［6－9］等。Rho／ROCK通路被稱為肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)器，也是細胞形態(tài)異質性的調節(jié)器［10］。目前越來越多的證據(jù)表明，Rho／ROCK在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，如樹突棘的形態(tài)發(fā)生、生長錐的形態(tài)、軸突的生長和導向延伸、肌球蛋白收縮、突觸的數(shù)量和塑形、細胞的增殖和分化等［11］。ROCK在缺氧誘導的少突膠質前體細胞分化中的作用尚不清楚，本研究應用ROCK特異性抑制劑Y27632，觀察Y27632特異性抑制ROCK對OGD損傷后少突膠質前體細胞分化的影響，探索ROCK通路在少突膠質前體細胞分化中的作用。

材料和方法

1.主要試劑及儀器

多聚賴氨酸、胰蛋白酶、DAPI購自美國sigma公司；胎牛血清、N2 supplement（100×）、B27 supplement（50×）購自美國 GIBCO公司；DMEM／F12培養(yǎng)基、DMEM／HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Rat－FGF－Basic、Human PDGF－AA、Rat－CNTF購自Peorotech公司；T3購自Invitrogen公司；Triton－X100購自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠O4抗體、兔抗大鼠NG2抗體、兔抗大鼠MBP抗體、小鼠抗大鼠A2B5抗體購自美國Millipore公司，兔抗ROCK2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；CY3標記羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗小鼠IgG購自美國Jackson公司；180℃高溫干烤箱；高壓蒸汽滅菌器超凈工作臺；渦旋振蕩器；電子移液槍臺式低溫離心機；CO2恒溫培養(yǎng)箱；37℃恒溫搖床；正、倒置熒光顯微鏡；實驗動物為SPF級出生3 d內(nèi)SD大鼠乳鼠，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供。

2.大鼠少突膠質前體細胞（OPCs）培養(yǎng)及誘導分化

根據(jù)文獻介紹振搖并差速貼壁法分離純化培養(yǎng)OPCs［12］。取3 d內(nèi)新生的SD大鼠乳鼠的全腦，剔除腦膜，經(jīng)過消化、過濾、離心步驟后，細胞接種到用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d左右，原代混合膠質細胞長滿。封閉培養(yǎng)瓶，置于37℃恒溫搖床180 rpm預搖1 h，棄上清，以去除小膠質細胞。繼續(xù)37℃恒溫搖床振搖180 rpm，過夜（約18 h），將OPCs從混合膠質細胞中搖下，通過差速貼壁法去除小膠質細胞和星形膠質細胞，離心后重懸，獲得純化的OPCs。細胞接種于鋪有蓋玻片（多聚賴氨酸預包被）的24孔板（用于免疫組化），或直徑60 mm培養(yǎng)皿（用于 Western blot檢測）中；OPCs接種后隔天換液（OPCs培養(yǎng)基：DMEM／F12，含 1×N2，1×B27，10 ng／ml PDGF－AA，10 ng／ml FGF－Basic），接種后3 d干預（換液為分化培養(yǎng)基：DMEM／F12，含1×N2，1×B27，10 ng／ml CNTF，30 ng／ml T3）。

3.細胞OGD干預及分組

細胞接種后3 d，將細胞分為對照組、對照＋Y27632組、OGD組、OGD＋Y27632組四組；OGD干預前各加藥組更換含10μmol／l Y27632培養(yǎng)基孵育1h（Y27632濃度參照［13］）；棄培養(yǎng)基，PBS清洗，OGD組更換為DMEM培養(yǎng)基（無糖無血清），OGD＋Y27632組更換為含10μmol／l Y27632DMEM培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2，1%O2缺氧培養(yǎng)箱中孵育2 h，對照組和對照＋Y27632組置于正常培養(yǎng)箱；OGD結束后各組細胞用PBS清洗后換回OGD前培養(yǎng)基，取OGD2h后再灌4 d細胞觀察。

4.細胞免疫熒光化學染色

取待固定細胞爬片PBS漂洗5 min，3次；用4℃冰箱預冷的4%多聚甲醛室溫固定30 min；傾去固定液，PBS漂洗5 min，3次；0.2%Triton／PBS液室溫透膜15 min；PBS漂洗5 min，3次；加封閉液（10%BSA－PBS），室溫封閉60 min；加預先用抗體稀釋液（5%BSA－PBS）按比例稀釋的一抗，4℃冰箱中孵育過夜；PBS漂洗5 min，3次，；加入按1∶200稀釋的二抗（CY3－抗兔，F(xiàn)ITC－抗鼠），室溫避光孵育60 min；加DAPI工作液（用PBS稀釋），室溫染色8 min；PBS漂洗5 min，3次；50%甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察。各一抗工作濃度為：小鼠抗大鼠A2B5抗體1∶200；兔抗大鼠NG2抗體1∶100；兔抗大鼠MBP抗體1∶200；小鼠抗大鼠O4抗體1∶200；兔抗大鼠ROCK2抗體1∶200；用PBS替代一抗作為免疫細胞化學染色的陰性對照。

5.Western blot檢測

取OGD干預后0 h和4 d后各組細胞，用含cocktail（10%v／v）的細胞裂解液冰上裂解并超聲破碎，離心后獲得蛋白上清。將20μg蛋白樣品通過12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉－TBST封閉1 h后，孵育兔抗大鼠MBP抗體（1∶1000）4℃過夜，洗膜，加入IRDye 800或 Alexa Fluor 800標記的IgG二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，TBST漂洗后Odyssey紅外成像儀器掃描PVDF膜。

6.統(tǒng)計學處理

結 果

1.少突膠質前體細胞（OPCs）培養(yǎng)鑒定

原代混合膠質細胞培養(yǎng)10 d左右有分層現(xiàn)象，下層為融匯成片的星形膠質細胞，上層為胞體小、折光性較強的小膠質細胞和OPCs，（圖1A）。經(jīng)過振搖并差速貼壁法純化的OPCs呈梭形、橢圓形或三角形，有雙極突起，部分為三個突起或者多個突起（圖1B）。免疫熒光組化顯示，95%以上的細胞表達OPCs特異性標志物A2B5和NG2（圖2）。用分化培養(yǎng)基替換OPCs培養(yǎng)基誘導分化后3 d，原OPCs突起增多變長，交織成網(wǎng)狀（圖1C），免疫熒光染色結果顯示，經(jīng)誘導分化的細胞表達成熟前期及成熟的少突膠質細胞OLs特異性蛋白O4和MBP（圖2），表示OPCs被定向誘導分化形成了OLs。

2.少突膠質前體細胞（OPCs）中ROCK2的表達

正常培養(yǎng)的OPCs經(jīng)過ROCK2和DAPI行免疫熒光雙標后，可見所有細胞均呈ROCK2免疫反應陽性。ROCK2免疫陽性熒光主要位于胞漿及突起（圖3）。

3.Y27632對OGD損傷后OPCs分化的影響

各處理組干預后顯微鏡下觀察（圖4）：處理當天細胞形態(tài)無明顯變化，仍為雙極性，4 d后細胞突起明顯增多變長，呈分化狀態(tài)；免疫熒光染色（圖4）顯示處理當天細胞幾乎不表達MBP，4 d后細胞表達MBP增多；Western blot結果顯示（圖5），處理當天細胞不表達MBP，4 d后細胞表達MBP增多，在4 d組中，單純OGD處理較對照組MBP表達明顯增多，加藥組比不加藥組MBP表達也明顯增多。

圖5 Y27632對于OGD后少突膠質前體細胞表達MBP的影響A：Western blot圖片顯示各組的MBP表達，B：各組MBP表達量的統(tǒng)計圖（n＝5；＃P＜0.01）。Fig.5 Effects of Y27632 on the expression of MBP following OGD A：Representative Western blot shows the changes in MBP expression in response to treatment，B：Statistical analysis of MBP expression（n＝5；＃P＜0.01）.

討 論

腦缺血缺氧性損傷不但影響灰質同時導致白質受損，引起一系列的神經(jīng)功能缺損癥狀。白質受損與少突膠質細胞系的壞死和凋亡密切相關［14］。白質損傷發(fā)生脫髓鞘改變后，成熟的少突膠質細胞自身不能修復。髓鞘再生需要內(nèi)源性的少突膠質前體細胞 （Oligodendrocyte precursor cells，OPCs，即NG2細胞）募集分化成為產(chǎn)生髓磷脂的少突膠質細胞［15］。OPCs分化為成熟的OLs需經(jīng)過一系列特定階段，包括增殖狀態(tài)的OPCs（表達NG2和A2B5標志物，具有雙極或三極形態(tài)），未成熟OLs（表達O4標志物，具有多極形態(tài)），最后是成熟的OLs（表達 MBP標志物）［16］。

Rho／ROCK通路被稱為肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)器，它普遍存在于機體各組織細胞中，其介導的信號通路參與細胞的收縮、粘附、遷移、增殖、細胞骨架的形成等［17］，Rho A／ROCK通道激活后可以影響細胞的增殖、分化、基因表達、細胞骨架的組裝、轉錄因子的激活、細胞周期的調節(jié)等生物學行為［18］。少突膠質前體細胞（OPCs）在發(fā)育為少突膠質細胞（即OLs）之前其細胞骨架需要經(jīng)過一系列變化，包括細胞突起增多及延長，ROCK通路與這些變化有著密切的聯(lián)系。但ROCK通路對OGD損傷后OPCs的分化影響尚不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，給予少突膠質前體細胞OGD 2 h干預后OPCs細胞表達MBP量較正常細胞增多，促進 OPCs的分化，與 Xiong等［19］和 Thomas等［20］的研究一致。分析可能原因：OGD 2 h損傷后成熟少突膠質細胞受損凋亡，髓鞘脫失，OPCs反應代償性分化發(fā)育為少突膠質細胞，促進髓鞘再生。同時我們的研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制ROCK不但可以促進正常OPCs的分化，同時可以促進OGD損傷后OPCs分化，提示ROCK信號通路對OPCs的分化起負向調控作用。Wang等［21］研究表明ROCK信號通道通過使 MLC（myosin light chain）磷酸化后激活NMⅡ（nonmuscle myosinⅡ），從而抑制少突膠質前體細胞的分化。我們推測Y27632特異性抑制ROCK，使MLC磷酸化減少，抑制NMⅡ的激活，從而促進OGD后OPCs分化。

綜上所述，ROCK信號通路在OPCs分化的過程中有重要的調控作用，通過對該通路的干預可能為研究神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘改變后促進少突膠質細胞髓鞘化提供新的思路。

［1］McCarthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol，1980，85：890－902

［2］Bu J，Banki A，Wu Q，et al.Increased NG2（＋）glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hyp0mye¨nating mutant shiverer.Glia，2004，48：51－63

［3］Zhu X，Bergles DE，Nishiyama A.NG2 cells generate both oligodendrncytes and gray matter astrocytes.Development，2008，135：145－l57

［4］Aguirre A，Gallo V.Postnatal neurogenesis and gliogenesis in the olfactory bulb from NG2－expressing progenitors of the subventricular zone.J Neurosci，2004，24：10530－10541

［5］Redwine JM，Armstrong RC.In vivo proliferation of oligodendrocyte progenitors expressing PDGFaR during early remyelination.Neurobiol，1998，37：413－428

［6］Anjana Jain，Robert J.Mc Keon，et al.Brady－Kalnay，eta1.Sustained Delivery of Activated Rho GTPases and BDNF Promotes Axon Growth in CSPG－Rich Regions Following Spinal Cord Injury.PLoS One，2011，6（1）：e16135

［7］Xian Huang，Jin－Mo Kimc，Tae Ho Kong，et al.GMCSF inhibits glial scar formation and shows long－term protective effect after spinal cord injury.Journal of the Neurological Sciences，2009，277：87－97

［8］Massey JM，Amps J，Viapiano MS，et al.Increased chondroitin sulfate proteoglycan expression in denervated brain－stem targets following spinal cord injury creates a barrier to axonal regeneration overcome by chondroitinase ABC and neurotrophin－3.Exp Neurol，2008，209：426－445

［9］Armin Buss，Katrin Pech，Byron A Kakulas，et al.NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.BMC Neurology，2009，10：1－15

［10］Numano F，Inoue A，Enomoto M，et al.Critical involvement of Rho GTPase activity in the efficient transplantation of neural stem cells into the injured spinal cord.Mol Brain，2009，2：37

［11］Yang P，Wen HZ，Zhang JH.Expressionof a domi nant－negative Rho－kinase promotes neurite outgrowth in a microenvironment mimicking injured central nervous system.Acta Pharmacol Sin，2010，31（5）：531－539

［12］Ying Ch，Veerakumar B，Jie P，et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cell.Nature Protocols，2007，2 （5）：1044－1051

［13］Zhi Yu Yu，Miao Liu，Xiang Luo，et al.ROCK inhibition with Y27632 promotes the proliferation and cell cycle progression of cultured astrocyte from spinal cord.Neurochemistry International，2012，61（7）：1114－1120

［14］Carloni S，Carnevali A，Cimino M，et al.Extended role of necrotic cell death after hypoxia－ischemia－induced neurodegeneration in the neonatal rat.Neurobiol Dis，2007，27：354－361

［15］Florencia L，Susana G，Analia L，et al.Progesterone attenuates astro－and microgliosis and enhances oligodendrocyte differentiation following spinal cord injury.Exp Neurol，2011，231（1）：135－46

［16］Gard AL，Williams WC，Burrell MR.Oligodendroblasts distinguished from O－2A glial progenitors by surface phenotype（O4＋GalC－）and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.Dev.Biol，1995，167：596－608

［17］Sheikh AM，Nagai A，Ryu JK，et al.Lysophosphatidylcholine induces glial cell activation：role of rho kinase.Glia，2009，57（8）：898－907

［18］Gopalakrishnan SM，Teusch N，Imhof C，et al.Role of Rho Kinase Pathway in Chondroitin Sulfate Proteoglycan－Mediated Inhibition of Neurite Outgrowth in PC12 Cells.J Neurosci Res，2008，86（10）：2214－2226

［19］Xiong，Man，Jin Li，Si－Min Ma，et al.Effects of hypothermia on oligodendrocyte precursor cell proliferation，differentiation and maturation following hypoxia ischemia in vivo and in vitro.Exp.Neurol，2013

［20］Thomas Schmitz，Stefanie Endesfelder，Li－Jin Chew，et al.Minocycline Protects Oligodendroglial Precursor Cells Against Injury Caused by Oxygen－Glucose Deprivation.Journal of Neuroscience Research，2012，90：933－944

［21］Haibo W，Tomasz R，Ambika T，et al.MyosinⅡIs a Negative Regulator of Oligodendrocyte Morphological Differentiation.Journal of Neuroscience Research，2012，90（8）：1547－1556

圖 版 說 明

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)（scale bar＝100μm）（A）脊髓混合膠質細胞 （B）純化后3 d的少突膠質前體細胞（C）誘導分化3 d的少突膠質細胞。

圖2 OPCs及其誘導分化為OLs細胞鑒定（scale bar＝40 μm）（A）－（D）為OPCs細胞鑒定，（E）－（H）為OPCs誘導分化后細胞鑒定結果。

圖3 免疫熒光顯示OPCs表達ROCK2（scale bar＝40μm）

圖4 Y27632對OGD損傷后OPCs分化的影響情況 （A1－A4）為對照組細胞，（B1－B4）為對照＋Y27632組細胞，（C1－C4）為 OGD 組細胞，（D1－D4）為 OGD＋Y27632組細胞；（A1－D1）為干預后當天倒置顯微鏡下細胞狀態(tài)，（A2－D2）為干預后第4 d倒置顯微鏡下細胞狀態(tài)（scale bar＝100μm），（A3－D3）為干預后0 d免疫熒光染色，（A4－D4）為干預后第4 d MBP和DAPI的免疫熒光染色。紅色為MBP，藍色為DAPI（scale bar＝40 μm）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Cells morphology under inverted microscope（scale bar＝100μm）（A）Spinal cord mixed glial cells（B）Oligodendrocyte precursor cells 3 days after purification（C）Oligodendrocytes differentiated of 3 days from oligodendrocyte precursor cells

Fig.2 Identification of OPCs and OLs differentiated from OPCs（scale bar＝40μm）（A）－（D）Identification of OPCs，（E）－（H）Identification of OLs differentiated from OPCs

Fig.3 The expression of ROCK2 in OPCs showed by immunofluorescence（scale bar＝40μm）

Fig.4 Effects of Y27632 on OPCs differentiation following OGD （A1－A4）Cells in control group，（B1－B4）Cells in control＋Y27632 group，（C1－C4）Cells in OGD group，（D1－D4）Cells in OGD＋Y27632 group；（A1－D1）Cells morphology under inverted microscope 0 day after treatment，（A2－D2）Cells morphology under inverted microscope 4 days after treatment（scale bar＝100μm），（A3－D3）Immunofluorescence of cells 0 day after treatment，（A4－D4）Immunofluorescence of cells 4 days after treatment.Double staining with MBP （red）／DAPI（blue）（scale bar＝40μm）.