單層扁平上皮鋪片標本制作方法的探索

楊世明 張敏海 張亦農(nóng) 汪薇曦 王小麗

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系組織胚胎學(xué)教研室，武漢430030）

單層扁平上皮在機體內(nèi)分布非常廣泛，具有重要的生理功能。制作高質(zhì)量的單層扁平上皮教學(xué)標本，可使學(xué)生在顯微鏡下清晰觀察并掌握其基本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，幫助學(xué)生進一步鞏固理論知識，加深理解機體組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間的關(guān)系，對于滿足實驗教學(xué)要求、保證教學(xué)效果等具有重要意義。本實驗從動物種屬、照射方式、硝酸銀濃度、浸染時間等方面對單層扁平上皮鋪片制作方法進行了較為系統(tǒng)的實驗研究。

材料和方法

1.實驗動物和主要試劑

健康成年的 Wister大鼠，家兔，狗均由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。硝酸銀購自美國Sigma公司。0.5－1%硝酸銀溶液：0.5－1g加100 ml雙蒸水，充分溶解后備用。

2.實驗方法

將大鼠和家兔麻醉后取腸系膜，將每種動物的材料分為兩部分。一部分放入盛有0.5－1%硝酸銀溶液的培養(yǎng)皿中，置于日光下照射；另一部分放入盛有0.5－1%硝酸銀溶液的培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下照射。時間15－60 min不等，以組織呈棕褐色為度。照射結(jié)束后，所有標本用蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分色數(shù)秒后再水洗。從腸系膜上取單層扁平上皮進行鋪片，晾干后用中性樹膠封片。狗的大網(wǎng)膜處理方法同上，但只進行日光照射。

結(jié) 果

將制作的單層扁平上皮鋪片標本置于顯微鏡下，選擇鋪成單層且背景較清楚的部位觀察。日光照射組中，大鼠、家兔、狗鋪片標本的上皮細胞均呈不規(guī)則形或多邊形，相鄰細胞之間有較大且多的棕褐色硝酸銀顆粒沉積，著色較深。胞質(zhì)內(nèi)的硝酸銀顆粒細小而分散。細胞核呈橢圓形，著藍色（圖1－3）。紫外燈照射的標本中，大鼠、家兔腸系膜上皮組織較松散，細胞形態(tài)欠完整。

圖1 大鼠腸系膜鋪片，硝酸銀染色×400圖2 家兔腸系膜鋪片，硝酸銀染色×400圖3 狗大網(wǎng)膜鋪片，硝酸銀染色×400Fig.1 Spread preparation of mesenteric，rat，silver nitrate staining×400Fig.2 Spread preparation of mesenteric，rabbit，silver nitrate staining×400Fig.3 Spread preparation of omentum，dog，silver nitrate staining×400

討 論

單層扁平上皮鋪片標本的鏡下觀察是組織學(xué)實驗教學(xué)的重要內(nèi)容，但制片過程費時且不易獲得薄而平整、著色均勻、結(jié)構(gòu)清晰的標本。制片受許多因素影響，如實驗動物的品種選擇、季節(jié)的不同、日光或紫外燈照射的強度、硝酸銀溶液的濃度、浸染時間的控制以及取材部位的選擇、鋪片技術(shù)、標本的處理和染色均直接影響制片效果。存在的較為普遍的問題是標本背景欠清晰、銀沉淀較多、細胞核模糊或不顯色等。為制作符合教學(xué)要求的鋪片標本，我們從實驗方法和實驗條件等方面進行了摸索。

據(jù)報道，郭青平等［1］取狗的大網(wǎng)膜作為實驗材料，入1%硝酸銀溶液中，利用日光或陽光照射的方法制片。任知春等［2］取兔、狗的大網(wǎng)膜或腸系膜，浸于1.5%硝酸銀溶液30－60 min，經(jīng)蒸餾水洗，置強日光或紫外線燈照射至棕色。水洗后入2.5%硫代硫酸鈉固定。再復(fù)染細胞核、分色、水洗、石碳酸－木榴油－二甲苯脫水透明、二甲苯透明、樹膠封片。王建新等［3］取家兔大網(wǎng)膜，入0.2%硝酸銀溶液中浸染，選擇了紫外線燈照射的方法。柳潔等［4］則采取了注射的方式，即將0.5%硝酸銀溶液緩慢注入小白鼠腹腔，30min后取大網(wǎng)膜鋪片。這些實驗均獲得了一定的結(jié)果。

為節(jié)省制片成本，我們選擇大鼠和家兔等小動物進行預(yù)實驗。鋪片時體會到日光照射的標本較紫外燈照射的標本組織的彈性和韌性要好，且浸染過程中觀察和操作非常方便，時間易控制。而紫外燈照射的大鼠、家兔腸系膜上皮組織相對較松散，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不夠完整，且照射時間不易掌握，操作不便。故在使用材料相對多的狗的大網(wǎng)膜做實驗時，直接采用日光照射而未用紫外燈照射，以獲得更多有用的鋪片標本。

我們分別使用了大鼠、家兔、狗等實驗動物。取材后直接進行浸染和光照還原，在實驗中簡化了操作。未采用硫代硫酸鈉還原，且省去了石碳酸－木榴油－二甲苯脫水透明及二甲苯透明的步驟。石碳酸具有強毒性和強腐蝕性［5］。我們將鋪片晾干后直接用中性樹膠封片。避免接觸這些揮發(fā)性大、對人體健康有害的有毒試劑。結(jié)果不同動物的單層扁平上皮細胞鋸齒狀邊界呈棕褐色線條，細胞核淡藍色，結(jié)構(gòu)較為清晰。在使用不同濃度的硝酸銀溶液進行比較時，觀察到選擇0.5%和1%的濃度，浸染效果差別不大。而浸染與光照還原要適度，浸染時間隨季節(jié)和日光的強弱不同需靈活掌握，以組織呈棕褐色為度。顏色過淺，則細胞邊界不清。反之，背景太深而影響觀察。從制片結(jié)果來看，大鼠的單層扁平上皮鋪片標本中細胞核的收縮較家兔明顯，而狗的鋪片標本的結(jié)構(gòu)保存相對較好，這種差別的產(chǎn)生是否與動物種屬等因素有關(guān)尚有待于進一步研究。

近年來，我們在組織學(xué)實驗教學(xué)方法和手段上進行了一些改革創(chuàng)新。應(yīng)用Motic數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)，將傳統(tǒng)的玻璃組織切片轉(zhuǎn)換為數(shù)字切片，提高了形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)效果［6］。但數(shù)字切片不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)玻璃切片的全部功能，制作適合于教學(xué)要求的單層扁平上皮鋪片標本是非常必要的。鑒于狗的大網(wǎng)膜可獲得較多的鋪片材料，因此更適合于教學(xué)標本的批量制作。

［1］郭青平，李莉.單層扁平上皮銀法中顯示方式的改良.實用醫(yī)技雜志，2008，15（10）：1265－1266

［2］胡登焜，楊森，劉志勛等.組織學(xué)特殊染色技術(shù)實踐.西安：陜西師范大學(xué)出版社，1989，46－47

［3］王建新，王瑋.單層扁平上皮標本制作技術(shù)的改進.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，36（4）：465

［4］柳潔，馬曉健.間皮細胞鍍銀染色法的改進.解剖學(xué)雜志，2005，28（6）：628

［5］汪薇曦，楊世明，葉翠芳等.一種應(yīng)用振蕩切片顯示神經(jīng)元的Cox染色法.解剖學(xué)報，2008，39（5）：779－781

［6］葉翠芳，李和，楊世明.數(shù)字切片在形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版），2008，10（4）：497－499