環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)志物在急性髓細(xì)胞性白血病中的研究進(jìn)展△

李明德，陳銘，姜輝，周秋梅，卜素，霍星星#

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究實(shí)驗(yàn)中心，合肥 230031

2安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)，合肥230031

急性髓細(xì)胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一種表現(xiàn)為未成熟的髓系細(xì)胞異常增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。2019年美國(guó)白血病新發(fā)61 780例，病死22 840例，其中AML占較大比例。AML的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，多項(xiàng)關(guān)于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究表明環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）可能通過吸附微小RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展與耐藥。因此，闡明AML致病及耐藥相關(guān)基因的分子機(jī)制，尋找潛在有效的AML生物標(biāo)志物，對(duì)于改善AML預(yù)后尤為重要。circRNA是一類閉合環(huán)狀非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），沒有5'-帽和3'-多聚腺苷酸尾，初次發(fā)現(xiàn)于類病毒，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是RNA異常剪接的副產(chǎn)物，無特定的生物學(xué)功能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在真核生物中，circRNA可參與機(jī)體生長(zhǎng)、衰老等多項(xiàng)生物進(jìn)程。此外，circRNA的異常表達(dá)已在AML和多種腫瘤組織中被證實(shí)。本文總結(jié)了circRNA在AML中的功能作用和研究進(jìn)展。

1 circRNA概述

1.1 circRNA來源與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

circRNA由RNA聚合酶Ⅱ合成，受剪接因子、順式作用元件、反式作用因子和表觀遺傳變化等多種因素的調(diào)控。目前，關(guān)于circRNA的生物起源已有多種假說：①前體mRNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA）發(fā)生外顯子跳讀，形成套索結(jié)構(gòu)并環(huán)化，產(chǎn)生circRNA；②pre-mRNA上通過小核糖體蛋白依次剪接加工后形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；③pre-mRNA上相鄰的剪接位點(diǎn)被RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）調(diào)控形成circRNA；④前體tRNA（precursor transfer RNA，pre-tRNA）經(jīng)過tRNA剪接核酸內(nèi)切酶復(fù)合物切割，其中內(nèi)含子末端被拼接形成tRNA內(nèi)含子環(huán)狀RNA（tRNA intronic circular RNA，tricRNA）。circRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)，也可儲(chǔ)存于外泌體中，其閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與大多ncRNA不同，可不受核酸外切酶的影響。

1.2 circRNA分類

目前，基于circRNA 形成機(jī)制，主要分為三大類：外顯子circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）、內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）和外顯子-內(nèi)含子 circRNA（exon-intron circRNA，EIcircRNA）。EcircRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其功能的發(fā)揮通過與miRNA或RBP的相互作用實(shí)現(xiàn)。相比EcircRNA，主要位于細(xì)胞核的ciRNA和EIcircRNA與miRNA結(jié)合位點(diǎn)較少。

1.3 circRNA生物學(xué)功能

circRNA生物學(xué)功能多樣，尚不完全清楚，目前主要有四種功能：①作為miRNA海綿；②作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；③作為蛋白質(zhì)適配器，通過與蛋白質(zhì)結(jié)合，circRNA可被激活并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；④作為蛋白質(zhì)翻譯載體，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，包含開放閱讀框的circRNA具有翻譯潛能，例如，circ-ZNF609含1個(gè)開放閱讀框，可以通過剪接依賴和非依賴帽子機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)。

2 circRNA在血液系統(tǒng)中的作用

circRNA在全血、血小板、外泌體等血液系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞組分中廣泛表達(dá)，其與機(jī)體的發(fā)育、衰老和相關(guān)疾病進(jìn)程密切相關(guān)，在血液系統(tǒng)的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。全血包含了血細(xì)胞和血漿所有成分。研究表明，血液成分或全血中存在大量的circRNA，其可能作為重要靶點(diǎn)影響疾病的進(jìn)程，也可能作為生物標(biāo)志物為診斷提供依據(jù)。Qian等發(fā)現(xiàn)circRNA在人外周血單核細(xì)胞中大量表達(dá)。Zhao等結(jié)合RNA微陣列分析數(shù)據(jù)，提出hsa_circ_0124644可能作為冠心病診斷生物標(biāo)志物的觀點(diǎn)。因此，全血中circRNA的異常表達(dá)可預(yù)示某些疾病的發(fā)生與進(jìn)展。血小板是一類體積小且形狀不規(guī)則的細(xì)胞碎片，來源于成熟巨核細(xì)胞，在止血、凝血和血管生成中起到重要作用。Alhasan等培養(yǎng)的成熟血小板中circRNA的相對(duì)比例顯著高于巨核細(xì)胞，幾種不同的circRNA也在血小板中被鑒定。然而，有關(guān)血小板中circRNA在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究仍較少，需要深入了解血小板中circRNA與miRNA和mRNA的相互作用關(guān)系，以為治療提供新的思路。目前，外泌體已成為細(xì)胞間信息傳遞的新媒介并受到日益關(guān)注。血漿中的外泌體是一類包含核酸和蛋白質(zhì)的盤狀雙層脂膜囊泡，可來源于多種血液細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。在血小板源的囊泡（外泌體和微囊）中，包裹著大量的circRNA，后者通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，調(diào)控受體細(xì)胞的生物活性。

3 circRNA與AML

circRNA可通過結(jié)合miRNA參與AML的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。circRNA與AML的各項(xiàng)進(jìn)程密切相關(guān)，可能作為AML診療的新靶點(diǎn)。

3.1 circRNA作為潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物

hsa_circ_0000370是由FLI-1基因衍生而來的一種新的環(huán)狀circRNA，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶-3（FMS-like tyrosine kinase-3，F(xiàn)LT3）來自Ⅲ型酪氨酸激酶受體亞家族，F(xiàn)LT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列（FLT3 internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD）突變預(yù)示AML預(yù)后不良和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加。Zhang等首次報(bào)道circ_0000370在FLT3-ITD突變陽(yáng)性AML中顯著升高，體外研究證實(shí)circ_0000370的過表達(dá)顯著抑制細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞存活率，表明circ_0000370可促進(jìn)AML進(jìn)展。TargetScan和KEGG結(jié)果顯示，circ_0000370通過負(fù)調(diào)節(jié)miRNA-1299，調(diào)控S100鈣結(jié)合蛋白A7A（S100 calcium binding protein A7A，S100A7A）基因的表達(dá)，影響AML的發(fā)展，S100A7A的上調(diào)也顯示不良預(yù)后。因此，circ_0000370-miRNA-1299-S100A7A軸與AML密切相關(guān)，circ_0000370可能是調(diào)控AML的關(guān)鍵基因。

hsa_circ_0001947是長(zhǎng)度為861 bp的circRNA，來源于AF4/FMR2家庭成員2（AF4/FMR2 family member 2，AFF2）基因的外顯子，其定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）產(chǎn)物中存在預(yù)期大小的頭尾剪接結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。AFF2由22個(gè)外顯子組成，具有復(fù)雜的可變剪接模式，參與細(xì)胞黏附、膠原生物合成和神經(jīng)元發(fā)育等多種生物學(xué)過程。Han等發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001947在新發(fā)和復(fù)發(fā)難治性AML患者中表達(dá)下調(diào)，且與AFF2 mRNA、CREB3調(diào)節(jié)因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF）mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，提示hsa_circ_0001947可能與AML的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。hsa_circ_0001947可通過吸附hsa-miRNA-329-5p調(diào)節(jié)hsamiRNA-329-5p靶基因CREBRF的表達(dá)，影響AML的進(jìn)展。研究表明hsa-miRNA-329-5p與Toll樣受體途徑和凋亡相關(guān)途徑相關(guān)。因此，hsa_circ_0001947可作為AML的預(yù)后生物標(biāo)志物，在AML進(jìn)展中起重要作用，為AML的治療提供新的見解。

hsa_circ_0121582是序列長(zhǎng)度為769 bp的circRNA，由線性糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）外顯子1到外顯子7反向剪接形成。Chen等發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中顯著低表達(dá)的circ_0121582將導(dǎo)致不良預(yù)后。WNT/β-catenin途徑相關(guān)蛋白異常表達(dá)是多數(shù)AML發(fā)生和發(fā)展的必要條件。circ_0121582可調(diào)節(jié)miRNA-224使GSK-3β表達(dá)增加，負(fù)調(diào)控該通路相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制AML細(xì)胞增殖。β-catenin作為WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞介質(zhì)，在AML細(xì)胞中表達(dá)增加，發(fā)生去磷酸化和核轉(zhuǎn)位。因此，circ_0121582可能通過miRNA-224作用于GSK-3β，抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路，抑制AML的發(fā)展。增加circ_0121582的表達(dá)可能是治療AML的重要方法。

circ-ANXA2是一種新的環(huán)狀RNA，Ding等研究發(fā)現(xiàn)，circ-ANXA2在AML細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，敲除circ-ANXA2表達(dá)，可能是通過增加THP-1和KG-1細(xì)胞中miRNA-23a-5p和miRNA-503-3p的表達(dá)，誘導(dǎo)THP-1和KG-1細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。因此，circ-ANXA2可作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，為AML的臨床治療提供新思路。

叉頭框蛋白 O3（fork head box O3，F(xiàn)OXO3）基因是來自叉頭框基因家族的腫瘤抑制基因，可參與調(diào)節(jié)人體的新陳代謝和細(xì)胞周期等進(jìn)程。circ-FOXO3由FOXO3基因編碼，通過p53和p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Zhou等發(fā)現(xiàn)接受初次治療的AML患者中circ-FOXO3和FOXO3的表達(dá)量顯著低于健康人群，提示circ-FOXO3可能作為AML的預(yù)后指標(biāo)。此外，Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)circ-FOXO3和FOXO3呈正相關(guān)。上述信息提示circ-FOXO3與AML的預(yù)后密切相關(guān)，可能作為AML的治療靶點(diǎn)。

circ_0009910是來源于線粒體融合蛋白-2的外顯子circRNA，定位于1號(hào)染色體的12049221～12052747區(qū)段。Ping等發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，circ_0009910的表達(dá)量明顯升高，其高表達(dá)與AML患者的風(fēng)險(xiǎn)增加和預(yù)后不良密切相關(guān)。降低circ_0009910表達(dá)可通過miRNA-20a-5p影響AML細(xì)胞增殖。

環(huán)狀RNA MYB原癌基因樣2（circular RNA MYB proto-oncogene like 2，circMYBL2）來自細(xì)胞周期檢查點(diǎn)基因MYBL2的pre-RNA的反向剪切，長(zhǎng)度為554 nt，涉及參考基因組hg38的外顯子8～9區(qū)域。Sun等發(fā)現(xiàn)circMYBL2在FLT3-ITD突變陽(yáng)性的AML中表達(dá)量升高，circMYBL2的低表達(dá)特異性抑制FLT3-ITD突變陽(yáng)性AML細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其分化，使FLT3激酶表達(dá)水平顯著降低，觸發(fā)FLT3-ITD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白 1（polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）的低表達(dá)抑制circMYBL2誘導(dǎo)的FLT3蛋白表達(dá)水平的增加，表明circMYBL2對(duì)FLT3的調(diào)節(jié)依賴PTBP1。因此，circMYBL2-PTBP1軸可能通過促進(jìn)FLT3/FLT3-ITD蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)FLT3-ITD AML的進(jìn)展。circMYBL2可能在FLT3-ITD突變型AML中發(fā)揮重要作用。

3.2 circRNA作為影響耐藥性的重要靶點(diǎn)

circPAN3起源于PAN3基因的13q12染色體上，其蛋白產(chǎn)物是PAN2/PAN3復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞單位，與AML的復(fù)雜核型密切相關(guān)，已引起廣泛關(guān)注。Shang等發(fā)現(xiàn)circPAN3在AML耐藥細(xì)胞株中表達(dá)增加，其機(jī)制可能是通過促分裂原活化的蛋白激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/MTOR途徑實(shí)現(xiàn)。沉默AML細(xì)胞中circPAN3基因后，其化療敏感性顯著提高，GO和KEGG分析表明circPAN3與miRNA-183和X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）呈負(fù)相關(guān)。miRNA-183促進(jìn)白血病細(xì)胞由G期向S期轉(zhuǎn)化，防止細(xì)胞凋亡。XIAP是一類拮抗細(xì)胞凋亡的蛋白，可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用受到circPAN3的影響。因此，在化療耐藥的AML患者中，circ-PAN3-miRNA-183-miRNA-153-XIAP軸與AML細(xì)胞的增殖有關(guān)，circPAN3可能是耐藥AML的有效治療靶點(diǎn)。

hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483是兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的circRNA。Li等構(gòu)建了耐多柔比星的HL-60細(xì)胞株，通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，篩選出1824個(gè)差異表達(dá)的circRNA，并構(gòu)建了AML耐藥相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，最終篩選出hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483作為AML耐藥相關(guān)的circRNA，可作為AML耐藥的潛在靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制仍有待探討。

4 小結(jié)與展望

目前，circRNA的研究已成為熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究表明，circRNA可作為miRNA的作用靶點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、蛋白質(zhì)接頭和蛋白質(zhì)翻譯因子，通過吸附miRNA發(fā)揮各種調(diào)控作用。但與其他線性RNA相比，circRNA的研究仍只是冰山一角，很多問題亟待解決：①缺乏統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫(kù)和具體的命名標(biāo)準(zhǔn)；②缺乏對(duì)circRNA功能的良好注解；③缺乏規(guī)范可行的circRNA檢測(cè)技術(shù)；④缺乏對(duì)circRNA相關(guān)調(diào)控機(jī)制的明確理解；⑤circRNA作為AML生物標(biāo)志物的可行性仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。隨著越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)與鑒定，其在AML中的功能和作用機(jī)制也將逐漸清晰。