抗菌肽的綠色制備及在糧食貯藏方面的應(yīng)用研究

趙云淼 何靜 張麗君 吳倩倩 張進(jìn) 孫靜

摘要：本研究旨在對(duì)解淀粉芽孢桿菌fmbj所產(chǎn)抗菌肽的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)米糠提取抗菌肽以提高發(fā)酵液中抗菌肽的效價(jià)。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件如米糠添加比例、吸附時(shí)間、溫度、pH進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取工藝為米糠添加比例100 g/L、吸附時(shí)間30 min、溫度為65℃、pH為4，期望將抗菌肽產(chǎn)品應(yīng)用于糧食貯藏，提高糧食保鮮率。

關(guān)鍵詞：抗菌肽;制備;糧食貯藏

抗菌肽是一類具有抑菌活性的多肽類物質(zhì)。它具有抑菌譜廣、穩(wěn)定性好以及安全性高等特點(diǎn)[1]。截止目前，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)收錄種類高達(dá)3180種。其中，動(dòng)物來(lái)源占74.09%;植物來(lái)源占11.07%;微生物來(lái)源占12.20%。與動(dòng)物源抗菌肽相比，微生物源抗菌肽具有發(fā)酵周期短、成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，因此，其具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景[2]。

米糠為稻谷和粟米等的加工副產(chǎn)物，主要由種皮、外胚乳、糊粉層和胚組成。我國(guó)米糠資源產(chǎn)量巨大，居世界之首。米糠富含油脂、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)素和生育酚、脂多糖、谷維素、二十八烷醇、α-硫酸鋅、角鯊烯、神經(jīng)酰胺等多種天然抗氧化及生理活性物質(zhì)[3]。然而，我國(guó)的米糠主要用于動(dòng)物飼料，僅有少量用于食用產(chǎn)品制備，資源利用率相比美國(guó)、日本等國(guó)家偏低。因此，米糠作為一種廉價(jià)但是營(yíng)養(yǎng)豐富的稻谷加工副產(chǎn)物就具有廣闊的利用前景[4]。

本研究?jī)?yōu)化了用米糠提取抗菌肽的條件，并對(duì)不同處理進(jìn)行多重比較，以探究米糠綠色制備抗菌肽的最佳工藝，提高資源的利用率，并將抗菌肽產(chǎn)品用于糧食的貯藏，提高糧食保鮮率，使糧食貯藏更加安全環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生產(chǎn)菌株

解淀粉芽孢桿菌fmbj（CGMCC 0943），保藏于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，采用蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、L-谷氨酸5 g、酵母浸膏1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸銅0.15 mg、硫酸鐵1.2 mg、硫酸錳5 mg，采用蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

種子培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，采用蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

1.1.3 試劑

胰蛋白胨（上海必優(yōu)生物科技有限公司）、酵母提取物（上海麥克林生化科技有限公司）、葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、L-谷氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、牛肉浸膏（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）等。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（冰山松洋生物科技有限公司）、pH計(jì)（奧豪斯儀器有限公司）、低溫冷凍離心機(jī)（上海耐圣卡蘭實(shí)業(yè)有限公司）、高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（國(guó)華儀器制造有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（南京賽百傲生物科技有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京賽百傲生物科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌fmbj的培養(yǎng)

將解淀粉芽孢桿菌fmbj在LB平板上進(jìn)行劃線，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取活化好的單菌落，接入到種子培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)24 h。將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，置于33℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵后的菌液8000 rpm離心20 min得發(fā)酵液上清。

1.2.2 抗菌肽的提取與檢測(cè)

準(zhǔn)確量取20 mL發(fā)酵液上清，用1 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至2.0，置于4℃冰箱中過(guò)夜;將過(guò)夜后的發(fā)酵液在8000 rpm、4℃條件下離心20 min，棄上清取沉淀;取1 mL的甲醇溶解沉淀物進(jìn)行萃取，4℃靜置過(guò)夜，10000 rpm、4℃離心2 min，棄沉淀，獲得抗菌肽粗提物，然后采用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后置于安培瓶中，置于4℃待測(cè)。采用高效液相色譜測(cè)定[5]，色譜柱為C18柱（Eclipse XDB，5μm 4.6×250 mm，安捷倫科技有限公司）;進(jìn)樣量為20 μL，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。其中流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸的水，流動(dòng)相B為含0.1%三氟乙酸的乙腈，具體的檢測(cè)條件參照Qian等的進(jìn)行[6]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)提取條件

米糠添加比例的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附溫度45℃、吸附時(shí)間90 min，在此基礎(chǔ)上考察不同添加比例（20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120g/L和140g/L）對(duì)抗菌肽提取率的影響。

吸附時(shí)間的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附溫度45℃、添加比例60 g/L，在此基礎(chǔ)上考察不同提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min和150 min）對(duì)抗菌肽提取率的影響。

吸附溫度的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附時(shí)間90 min、添加比例60 g/L，在此基礎(chǔ)上考察不同吸附溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃和75℃）對(duì)抗菌肽提取率的影響。

pH的確定：按照初始提取條件溫度45℃、吸附時(shí)間90 min、添加比例60 g/L，在此基礎(chǔ)上考察不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）對(duì)抗菌肽提取率的影響。

初始提取條件為：pH 7.0、吸附溫度45℃、吸附時(shí)間90 min、米糠添加比例60 g/L。

除單因素為變量外，其余提取條件不變，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠添加比例對(duì)抗菌肽提取率的影響

由圖1可知，在發(fā)酵液上清中添加不同比例的米糠對(duì)抗菌肽提取率有顯著的影響。當(dāng)米糠的添加量在20 g/L-100 g/L的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率隨著米糠添加量的增加而提高;其中以米糠的添加量在20 g/L-60 g/L時(shí)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率增幅最大;米糠的添加量在100 g/L-140 g/L時(shí)，抗菌肽的提取率未出現(xiàn)顯著變化。由此可確定米糠添加比例為100 g/L時(shí)抗菌肽的提取率最高。

2.2 吸附時(shí)間對(duì)抗菌肽提取率的影響

由圖2可知，米糠在發(fā)酵上清液中吸附時(shí)間的不同對(duì)抗菌肽的提取率影響顯著。當(dāng)吸附時(shí)間在30 min - 60 min的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率隨著吸附時(shí)間的增加而降低;當(dāng)吸附時(shí)間在60 min - 120 min的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率隨著吸附時(shí)間的增加而提高;其中以吸附時(shí)間在60 min - 90 min時(shí)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率增幅最大;以吸附時(shí)間在90 min - 120 min時(shí)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率增幅緩慢;當(dāng)吸附時(shí)間在120 min - 150 min的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率隨著時(shí)間的增加而降低?？梢钥闯霎?dāng)吸附時(shí)間為30 min和120 min時(shí)，抗菌肽提取率都接近70 %，在減少資源消耗的情況下，可以確定吸附時(shí)間30 min為最優(yōu)提取條件。

2.3 吸附溫度對(duì)抗菌肽提取率的影響

由圖3可知，在發(fā)酵液上清中吸附溫度的不同對(duì)米糠提取抗菌肽有著顯著影響。當(dāng)吸附溫度在25℃ - 45℃ 的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率變化不顯著;當(dāng)吸附溫度在45℃ - 65℃的范圍內(nèi)，米糠提取發(fā)酵液上清中抗菌肽隨著吸附溫度的增加而提高;其中以吸附溫度在45℃ - 55℃ 時(shí)，抗菌肽的提取率增幅最大;當(dāng)吸附溫度在65℃ - 75℃ 的范圍內(nèi)，米糠對(duì)抗菌肽的提取率隨著溫度的增加而降低。由此可確定吸附溫度為65℃ 時(shí)抗菌肽的提取率最高。

2.4 pH對(duì)抗菌肽提取率的影響

由圖4可知，pH的不同顯著影響米糠對(duì)抗菌肽的提取率。隨著pH的升高，發(fā)酵液上清中抗菌肽的提取率大體呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH在4-7的范圍內(nèi)及在8-9的范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率下降趨勢(shì)明顯;當(dāng)pH在7-8范圍內(nèi)，發(fā)酵液上清中抗菌肽提取率無(wú)顯著變化。可以看出pH值越小越有利于抗菌肽的提取，而在pH=4時(shí)提取率已高達(dá)96%，則可選取pH=4為最佳提取條件。

3 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)米糠提取解淀粉芽孢桿菌fmbj（CGMCC 0943）所產(chǎn)抗菌肽的提取條件進(jìn)行的單因素實(shí)驗(yàn)表明，添加比例100 g/L、吸附時(shí)間30 min、提取溫度65℃、pH=4時(shí)提取率最高。本文只通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，后期仍需在此基礎(chǔ)上進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)，以篩選出影響提取率的主要因素，通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件。在最優(yōu)條件下進(jìn)行抗菌肽的提取，以低成本、高效率的方式得到綠色環(huán)保的抗菌肽產(chǎn)品，可作為添加劑應(yīng)用在糧食儲(chǔ)藏中，通過(guò)抗菌肽對(duì)霉菌的抑制作用，延長(zhǎng)糧食的保存期。

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