溫度脅迫對(duì)湖北釘螺部分呼吸酶的影響

潘中武，桂琳，胡霞，章琴，周書林

1.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校解剖學(xué)教研室；3.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室

湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)簡(jiǎn)稱釘螺，為兩棲淡水生物，是日本血吸蟲的唯一中間宿主。釘螺分布范圍廣，孳生環(huán)境復(fù)雜，其分布與溫度等環(huán)境因素相關(guān)，溫度可以影響釘螺體內(nèi)多種酶的活性[1]。既往研究表明，釘螺體內(nèi)存在細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)[2]。COX為線粒體標(biāo)志性酶，是生物氧化呼吸鏈中的末端酶，線粒體借助該酶將電子傳遞給氧，進(jìn)而獲得能量，為細(xì)胞代謝提供必要的ATP來(lái)源；SDH是動(dòng)物有氧氧化過(guò)程中三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是線粒體能量代謝、糖的有氧氧化的重要標(biāo)志酶，其活性與生殖細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)育等生命活動(dòng)相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種化學(xué)物質(zhì)(如滅螺藥)均可影響釘螺體內(nèi)COX和SDH等多種酶活力[3-4]；在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬春季外界氣候變化，釘螺體內(nèi)COX和SDH等酶活力也發(fā)生相應(yīng)的變化[5]。

本研究在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，觀察湖北釘螺在高溫和低溫脅迫作用下，釘螺軟體組織中COX和SDH含量變化情況，以期豐富溫度對(duì)釘螺影響的研究，為進(jìn)一步控制釘螺提供參考。

1 材料與方法

1.1釘螺來(lái)源 于2019年3—5月采集湖北釘螺，采集地點(diǎn)為安徽省蕪湖市灣沚區(qū)青弋江支流趙家河段有螺江灘，經(jīng)逸蚴法判定為陰性釘螺，選取有7～8個(gè)螺旋、活力較強(qiáng)的成螺在實(shí)驗(yàn)室用去離子水馴養(yǎng)兩周后備用。

1.2主要儀器和試劑 手持均質(zhì)器(SFJ-10)購(gòu)自力辰科技股份有限公司，多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200pro)購(gòu)自帝肯貿(mào)易有限公司。細(xì)胞色素氧化酶(COX)和琥珀酸脫氫酶(SDH)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司，4 ℃保存。

1.3釘螺分組及處理 將實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)的釘螺隨機(jī)分成3組，分別為低溫脅迫組(下稱低溫組)、對(duì)照組、高溫脅迫組(下稱高溫組)，每組40只，每組均設(shè)3個(gè)平行組。將釘螺放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，所有培養(yǎng)皿均先放置一層海綿，上面再覆蓋一層粗草紙，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)皿中均始終保持一定的濕度(培養(yǎng)皿中積水不超過(guò)草紙面)。高溫組和低溫組分別放在37 ℃和4 ℃搖床中，對(duì)照組直接放在20 ℃的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室內(nèi)，24 h后將釘螺放置在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.4COX和SDH含量的測(cè)定 將釘螺從-80 ℃冰箱中取出后立即解凍，用鑷鉗十字交叉法[6]碾壓釘螺后，在體視顯微鏡下剔除螺殼，取出軟體組織置于EP管中備用。取0.10 g軟體組織，加入1 mL生理鹽水，冰上勻漿，3 000 r/min離心30 min(離心半徑為7.25 cm)取上清液備用。按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣品測(cè)出的OD值代入方程，分別計(jì)算釘螺COX和SDH含量(按說(shuō)明書步驟操作，樣品已被稀釋5倍，故最終結(jié)果乘以5才是樣本的實(shí)際濃度)。

2 結(jié) 果

2.1釘螺COX含量 COX標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.222 2+0.013 6x-0.000 02x2，R2=0.995 0。對(duì)照組釘螺COX含量為(27.11±2.31)U/L，低溫組和高溫組分別為(21.90±0.32)U/L和(21.42±1.84)U/L，三組間不全相同，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.145，P<0.05)。與對(duì)照組相比，低溫組和高溫組釘螺COX含量均下降，且差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2釘螺SDH含量 SDH標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.008 5+0.157 1x-0.002 6x2，R2=0.998 3。對(duì)照組釘螺SDH含量為(1.30±0.002)U/L，低溫組和高溫組分別為(1.24±0.05)U/L和(1.12±0.02)U/L，三組間不全相同，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=124.624，P<0.05)。與對(duì)照組相比，低溫組和高溫組釘螺SDH含量均下降，其中高溫組下降更為明顯，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討 論

脅迫原本用于逆境生理學(xué)的研究中，是生物所處的不利環(huán)境的總稱。不同學(xué)者對(duì)脅迫均有不同的理解，其基本內(nèi)涵是指對(duì)生物生存與發(fā)育不利的各種外界環(huán)境因子(包括生物因素與非生物因素)的總和[7]。環(huán)境因子中溫度是一種可以對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生重要影響的生態(tài)因子，在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，動(dòng)物可以進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，而超出這個(gè)范圍就會(huì)引起生理活動(dòng)異常，超出的范圍過(guò)大就會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡[8]。溫度或溫度與其他環(huán)境因子共同作用可以影響動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖及代謝等生理活動(dòng)[9]。

線粒體是產(chǎn)生ATP以及細(xì)胞呼吸的部位，與呼吸相關(guān)的酶主要有COX、SDH、NADH 等[10]。COX是線粒體呼吸鏈中電子傳遞過(guò)程的終末復(fù)合物，是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化的關(guān)鍵酶，也是線粒體標(biāo)志酶[11]，COX在釘螺體內(nèi)分布廣泛[1]。SDH屬于膜結(jié)合酶，存在于所有的有氧呼吸細(xì)胞中，能與線粒體膜牢固結(jié)合，屬于脫氫酶中最重要的酶[11]，SDH廣泛存在于釘螺軟體組織中[1]。因此COX和SDH的活性可在一定程度上反映有氧代謝的水平。研究溫度脅迫狀態(tài)下釘螺軟體組織中COX和SDH活性的變化，對(duì)于揭示釘螺所需能量與溫度之間的關(guān)系以及代謝水平均有重要的意義。

戴超[12]研究了溫度對(duì)三疣梭子蟹呼吸代謝酶的影響，陸君[13]等研究了低溫對(duì)擬穴青蟹抗氧化酶活性的影響，連春盎[14]研究了干露脅迫對(duì)脊尾白蝦呼吸代謝相關(guān)酶COX的影響，以上研究均發(fā)現(xiàn)外界溫度的改變對(duì)動(dòng)物體內(nèi)各種呼吸代謝酶會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響。釘螺的最適宜生存溫度為20～26 ℃，本研究發(fā)現(xiàn)在非適宜溫度條件下，釘螺體內(nèi)兩種呼吸酶含量均有改變。低溫或者高溫脅迫狀態(tài)下釘螺體內(nèi)琥珀酸脫氫酶含量下降，這與趙偉民、宋志明等[15-16]研究的溫度對(duì)白條錦蛇和點(diǎn)籃子魚幼魚SDH活性影響結(jié)果一致。低溫或高溫脅迫狀態(tài)下釘螺體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶含量同樣也下降，這一結(jié)果與路允良[17]研究的溫度對(duì)三疣梭子蟹代謝酶COX的影響結(jié)果一致。

變溫動(dòng)物最重要的生物學(xué)特征之一是其體溫隨著環(huán)境溫度的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化，而動(dòng)物的體溫又直接影響著動(dòng)物體內(nèi)酶的活性并最終決定其新陳代謝的水平，影響各種組織器官執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能[18]。當(dāng)環(huán)境溫度在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)發(fā)生改變時(shí)，變溫動(dòng)物通過(guò)體內(nèi)生化體系的多種重構(gòu)途徑以消除或部分消除溫度變化對(duì)機(jī)體造成的影響，從而維持生物體正常的新陳代謝活動(dòng)。但當(dāng)環(huán)境溫度變化的幅度超過(guò)一定的范圍，如冬季或夏季，部分變溫動(dòng)物會(huì)逐漸適應(yīng)這種溫度變化，不斷降低新陳代謝水平直至進(jìn)入休眠狀態(tài)(冬眠或夏蟄)。本研究結(jié)果表明，在溫度脅迫狀態(tài)下釘螺兩種呼吸酶的活性均表現(xiàn)為下降，可能是通過(guò)抑制線粒體代謝，使有氧呼吸提供的能量減少，從而降低物質(zhì)和能量消耗來(lái)對(duì)抗溫度脅迫，但釘螺對(duì)溫度脅迫的耐受程度及具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。