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    IL-10調(diào)節(jié)日本血吸蟲感染小鼠肝臟炎癥和纖維化的實(shí)驗(yàn)觀察

    2021-11-10 03:29:40金郁劉道華金偉呼明闖汪奇志
    熱帶病與寄生蟲學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:血吸蟲單核細(xì)胞纖維化

    金郁,劉道華,金偉,呼明闖,汪奇志

    安徽省血吸蟲病防治研究所,安徽 合肥 230601

    日本血吸蟲感染宿主后,沉積在肝臟的蟲卵會招募許多免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞等)至肝臟中,分泌促炎和促纖維化因子,持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致肝臟纖維化。在血吸蟲感染小鼠的早期,外周Ly6Chi單核細(xì)胞依靠CCL2-CCR2、CCL1-CCR8、CCL3/4/5-CCR1/5、CXCL10-CXCR3等趨化因子及其受體相互作用浸潤至肝臟[1-4],Ly6Chi單核細(xì)胞發(fā)育成Ly6Chi巨噬細(xì)胞,加重炎癥和肝損傷;Ly6Chi巨噬細(xì)胞在后期會轉(zhuǎn)化為Ly6Clo巨噬細(xì)胞,分泌基質(zhì)金屬蛋白酶、生長因子、吞噬相關(guān)蛋白等組織修復(fù)因子,起到修復(fù)組織的作用[5]。

    小鼠體內(nèi)B細(xì)胞分為B1a、B1b和B2三個細(xì)胞亞群,其中B1細(xì)胞可以分泌IL-10。IL-10在負(fù)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用,是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子。IL-10可以通過多種機(jī)制來介導(dǎo)炎癥的負(fù)調(diào)節(jié),如維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能、限制促炎細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生、下調(diào)MHCⅡ的表達(dá)等[6-7]。在腎纖維化中,IL-10缺陷型小鼠在單側(cè)輸尿管梗塞發(fā)病后,觀察到更加嚴(yán)重的腎臟炎癥和纖維化,炎性細(xì)胞浸潤增多,細(xì)胞因子MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-6、IL-8、MCF上調(diào)[8],表明IL-10在多種器官纖維中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用,其在日本血吸蟲病肝纖維化的作用值得深入研究。本文利用日本血吸蟲感染小鼠模型,通過觀察IL-10R阻斷后小鼠的肝臟炎癥及纖維化發(fā)展,探究IL-10在日本血吸蟲感染急性期的作用及其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 8~10周雌性野生型C57BL/6小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

    1.1.2主要儀器與試劑 離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀分別為美國Beckman公司、BD公司和Bio Tek 公司產(chǎn)品。小鼠IL-6、IL-12 p40、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司;小鼠CCL2、CCL3、CCL4、CCL5 Flex Set和CBA Mouse Soluble Protein Maser Buffer Kit試劑盒購自美國BD公司;ALT檢測試盒購自南京建成公司;PCR試劑盒購自日本TAKARA公司;IL-10R阻斷單克隆抗體和大鼠免疫球蛋白G1(Rat IgG1)購自北京安諾倫生物技術(shù)公司。

    1.2方法

    1.2.1日本血吸蟲感染小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用腹部貼片法感染30只小鼠,每只感染18~20條日本血吸蟲尾蚴。于小鼠感染后第2 d開始,隨機(jī)分為數(shù)量相等的2組,實(shí)驗(yàn)組每2周腹腔注射1次IL-10R阻斷單克隆抗體,每只鼠每次注射250 μg,共注射3次,對照組相同方法注射Rat IgG1;于感染后第6周處死小鼠,眼球取血,將血液室溫靜置30 min后離心10 min(1 200×g,4 ℃)進(jìn)行血清分離、收集;同時收集肝臟樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測 根據(jù)說明書進(jìn)行操作,檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清ALT水平。

    1.2.3蘇木精-伊紅(HE)和天狼星紅染色 肝臟樣本進(jìn)行組織脫水、石蠟包埋、制成5μm切片,脫蠟至水。HE染色:蘇木精染色8 min,將肝臟樣本胞核變藍(lán)為止;伊紅染色3 s,流水沖洗5 min;烘干,中性樹脂封片。天狼星紅染色:天狼星紅染料染色30 min,流水沖洗5 min,烘干,封片。

    1.2.4小鼠肝臟免疫細(xì)胞分離 剪碎小鼠肝臟樣本,加入0.05%消化液放置搖床上,37 ℃,200 rpm,消化60 min;補(bǔ)滿1×PBS終止消化后 200目篩網(wǎng)過濾;離心,50×g,2 min,4 ℃,2~3次,去除肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞;留上清,500×g,10 min,4 ℃,收集細(xì)胞沉淀,用1×PBS洗1次,收集細(xì)胞沉淀;加入40% Percoll重懸細(xì)胞沉淀并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中,1 260×g,30 min,20 ℃;吸除上層所有液體,收集細(xì)胞沉淀;加入1×ACK裂解紅細(xì)胞,冰上裂解紅細(xì)胞5 min,用1×PBS洗1次,收集細(xì)胞;將得到的細(xì)胞分離,制成單細(xì)胞懸液,3%冰醋酸適當(dāng)稀釋,用細(xì)胞計數(shù)板在低倍鏡下計數(shù),計算出相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。

    1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面marker 制備單細(xì)胞懸液:收集細(xì)胞,用1×PBS洗1次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/100 μL。封閉Fc受體:加入5 μL正常大鼠血清,混勻,4 ℃孵育30 min。標(biāo)記抗體:加入相應(yīng)預(yù)混的抗體(PE/Cy7-CD45、PerCP/Cy5.5-F4/80、PE-CD11b、FITC-Ly6C),混勻,4 ℃避光孵育30 min。洗滌后檢測:用Wash Buffer洗滌2次后,加入200 μL 1×PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測。

    1.2.6RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 取適量肝臟組織,加入1 mL Trizol,勻漿機(jī)勻漿后,根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行RNA提??;提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,參照文獻(xiàn)[9],引物序列如表1。

    表1 不同基因引物序列

    1.2.7相關(guān)因子檢測 肝臟勻漿后,離心取上清,采用ELISA試劑盒檢測小鼠肝臟局部IL-6、IL-12 p40、TNF-α,CBA及Flex Set試劑盒檢測CCL2、CCL3、CCL4、CCL5,根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

    1.3統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,利用兩側(cè)不配對的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1小鼠肝臟肉芽腫和血清ALT變化 實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟單個蟲卵肉芽腫較對照組增大(t=4.817,P<0.05),膠原沉積更多(圖1A和1B),且血清ALT水平更高(t=5.505,P<0.05)(圖1C)。

    注:A為HE和天狼星紅染色;B為單個肉芽腫大小統(tǒng)計;C為血清ALT檢測。**表示P<0.01。

    2.2小鼠肝臟巨噬細(xì)胞和相關(guān)因子變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟駐留的巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞,KCs)在IL-10R被阻斷后細(xì)胞比例和數(shù)目均顯著增多(t=18.85、3.19,P均<0.05);促炎性Ly6Chi巨噬細(xì)胞比例增多(t=27.63,P<0.05),細(xì)胞數(shù)目無變化(t=3.92,P>0.05);而修復(fù)性Ly6Clo巨噬細(xì)胞比例及數(shù)目均顯著減少(t=17.87、25.69,P均<0.05)(圖2)。

    注:A為典型流式圖,KCs:F4/80hi CD11bint,外周浸潤的巨噬細(xì)胞:F4/80int CD11bhi;B為細(xì)胞比例統(tǒng)計;C為細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計。**表示P<0.01。

    實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟CCL2、CCL3、CCL4、CCL5的mRNA表達(dá)較對照組升高(t=19.85、15.79、37.79、28.94,P均<0.05),CCL2、CCL3的蛋白含量也升高(t=2.308、2.619,P均<0.05);此外,TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b的mRNA相比于對照組表達(dá)量增多(t=90.42、26.75、123.9、46.18、4.687,P均<0.05),TNF-α的蛋白含量升高(t=36.29,P<0.05)(圖3)。

    注:A為定量PCR檢測的mRNA水平;B為ELISA和CBA檢測的蛋白水平。*表示P<0.05,**表示P<0.01。

    3 討 論

    IL-10在免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用,所以在多種器官纖維化中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用。有實(shí)驗(yàn)觀察到吸入二氧化硅的小鼠肺和支氣管肺泡灌洗液中IL-10顯著增多,說明IL-10與肺纖維化有緊密的聯(lián)系,IL-10缺陷型小鼠經(jīng)二氧化硅氣管滴注后,觀察到更加嚴(yán)重的肺部炎癥[10]。Rodell等用透明質(zhì)酸水凝膠包裹IL-10,對腎纖維化組織進(jìn)行局部免疫治療后,腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤、凋亡的細(xì)胞、纖維化區(qū)域都明顯降低[11-12]。CCl4誘導(dǎo)的IL-10缺陷型小鼠肝纖維化中,檢測到更高的TNF-α水平和更加嚴(yán)重的肝纖維化[13-14]。本研究在日本血吸蟲感染小鼠的模型中,使用IL-10R阻斷抗體處理感染的小鼠后,發(fā)現(xiàn)肝臟促炎性巨噬細(xì)胞和炎性因子顯著增多,肝臟炎癥加重;天狼星紅染色顯示IL-10R阻斷抗體處理的感染小鼠肝臟膠原沉積增多,提示IL-10可能與血吸蟲病肝臟纖維化有關(guān)。

    當(dāng)肝臟受到損傷,肝臟內(nèi)枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞活化,分泌趨化因子如CCL2,會招募大量的Ly6Chi單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肝臟中,隨后發(fā)育為促炎型Ly6Chi單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。肝臟促炎性Ly6Chi巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的促炎表型,表達(dá)多種炎性趨化因子和細(xì)胞因子,是加重肝損傷的“罪魁禍?zhǔn)住盵15-16],在MCD和CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中,Ly6Chi單核細(xì)胞在前期浸潤至肝臟中發(fā)育成熟為Ly6Chi巨噬細(xì)胞,釋放促炎和促纖維化因子,促進(jìn)了炎癥反應(yīng)、肝損傷和肝纖維化[17-20]。本研究發(fā)現(xiàn),在小鼠血吸蟲病肝纖維化模型中阻斷IL-10R后,小鼠肝臟中的趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表達(dá)量相較對照組增高,說明當(dāng)IL-10缺失后,對CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表達(dá)限制的降低,失去了對Ly6Chi單核細(xì)胞的浸潤至肝臟的抑制,表現(xiàn)出肝臟促炎性Ly6Chi巨噬細(xì)胞顯著增多,導(dǎo)致肝臟膠原沉積增多,說明IL-10可能是通過調(diào)控Ly6Chi巨噬細(xì)胞數(shù)量來調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)。同時有研究表明,TNF-α和IL-6可以直接活化肝臟星形細(xì)胞,獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì),大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積則引起肝纖維化。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-10R會限制炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b)的表達(dá),同時會降低TNF-α的表達(dá),說明IL-10可以通過限制TNF-α和IL-6的表達(dá),進(jìn)而對血吸蟲病早期的肝臟炎癥及后期發(fā)展的肝纖維化產(chǎn)生影響。

    綜上,本研究間接證明了IL-10可能通過調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá),抑制了Ly6Chi巨噬細(xì)胞向肝臟的浸潤,減少了炎性細(xì)胞釋放促炎和促纖維化因子,對肝纖維化產(chǎn)生影響。但是由于肝臟免疫微環(huán)境的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,不排除Ly6Chi單核細(xì)胞可能會受到其他免疫細(xì)胞的影響,因此具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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