草菇多酚氧化酶基因的克隆與表達(dá)分析

劉 明，劉海峰，周 慧，何煥清，肖自添，羅學(xué)梅

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備研究所，廣東 廣州 510630；3.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州 510520）

【研究意義】草菇（Volvariella volvacea），別名南華菇、蘭花菇、美味草菇及中國(guó)菇等，是一種生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶地區(qū)的食用菌，其人工栽培技術(shù)起源于中國(guó)［1］。新鮮草菇肉質(zhì)脆嫩，易受到機(jī)械損傷，因具有強(qiáng)烈的呼吸作用和代謝活動(dòng)，采后1～2 d 子實(shí)體萎縮褐變，價(jià)值顯著降低，新鮮草菇長(zhǎng)時(shí)間貯藏和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸較難實(shí)現(xiàn)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，草菇發(fā)生褐變主要與多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性、維生素C 及總酚含量有關(guān)。在PPO 作用下酚類(lèi)底物氧化形成黑色素的醌類(lèi)物質(zhì)，促使草菇快速褐變［3］。在運(yùn)輸過(guò)程中受到機(jī)械損傷的影響，草菇組織破裂會(huì)導(dǎo)致酚類(lèi)底物與PPO 接觸，從而加速褐變反應(yīng)［4］?？寺〔⒎治霾莨絇PO 基因家族對(duì)草菇抗褐變品種選育及改良有重要參考價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PPO 是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物、細(xì)菌和真菌中的含銅酶。PPO 可根據(jù)底物特異性和結(jié)構(gòu)分為酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）、兒茶酚氧化酶（EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）［5］。在食用菌中如雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、香菇（Lentinula edodes）、滑子菇（Pholiota nameko）、平菇（Pleurotus ostreatus）、玉木耳（Auricularia cornea）等已鑒定多個(gè)多酚氧化酶，其中在香菇中分離到1 個(gè)多酚氧化酶基因，表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)該基因在菌絲期到轉(zhuǎn)色期表達(dá)量逐漸升高，在原基形成后表達(dá)量降低，該基因可能與香菇的轉(zhuǎn)色有關(guān)［6-7］；在對(duì)滑子菇的研究中分離到1 個(gè)42 ku 的多酚氧化酶，該酶以活性前體的形式表達(dá)，在蛋白酶的作用下切割C 端序列而生成有活性的成熟酶［8］；在平菇中分離到1 個(gè)75 ku 的酪氨酸酶，該酶具有較高比活力，可用于食品工業(yè)［9］；在玉木耳中克隆到1 個(gè)多酚氧化酶，其在菌絲期表達(dá)量較低在子實(shí)體中表達(dá)量較高［10］。在雙孢菇中已克隆鑒定出6個(gè)PPO 基因［11］，利用CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)對(duì)雙孢蘑菇基因組中1 個(gè)多酚氧化酶基因進(jìn)行編輯，使得PPO 酶活降低30%，有效減緩了雙孢蘑菇的褐變現(xiàn)象［12］。

【本研究切入點(diǎn)】草菇基因組測(cè)序的完成對(duì)草菇基因功能的研究起到了極大的促進(jìn)作用［13］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，從草菇中篩選和克隆獲得PPO 基因家族成員，分析其家族序列特征，分析該家族在各個(gè)發(fā)育時(shí)期和組織部位的表達(dá)差異，為進(jìn)一步進(jìn)行遺傳改良提供參考?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析研究草菇中PPO 基因家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式，以期為解析草菇褐變機(jī)理積累數(shù)據(jù)，為草菇抗褐變、耐存儲(chǔ)品種選育等提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草菇菌株v26，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所食用菌菌種保藏中心。菌絲培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基，出菇培養(yǎng)基為50%稻草、50%棉籽殼，含水量65%。

1.2 試驗(yàn)方法

出菇試驗(yàn)于2021 年3 月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鐘落潭白云試驗(yàn)基地進(jìn)行，于菌絲期、原基期、蛋形期、成熟期4 個(gè)不同時(shí)期取樣。另外，在蛋形期對(duì)外菌膜、菌柄、菌蓋3 個(gè)不同部位進(jìn)行取樣，迅速用液氮冷凍，然后于-80 ℃保存，備用。

1.2.1 VvPPO 基因家族序列獲得 根據(jù)廣東省蔬菜新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2015 年測(cè)得的草菇菌絲轉(zhuǎn)錄組結(jié)果（PRJNA408191）和公布的草菇基因組信息（NCBI 登錄號(hào)：GCA_000349905），篩選得到功能注釋為PPO 的4 個(gè)基因全長(zhǎng)序列，分別命名為VvPPO1（MZ322862）、VvPPO2（MZ440853）、VvPPO3（MZ440854）、VvPPO4（MZ440855）。據(jù)此設(shè)計(jì)CDS全長(zhǎng)引物，設(shè)計(jì)VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3和VvPPO4基因序列引物和CDS 引物，引物信息見(jiàn)表1。

采用生工生物工程（上海）股份有限公司總RNA 提取試劑盒提取草菇菌絲RNA，采用賽默飛有限公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用CTAB 法提取草菇DNA。以草菇菌絲cDNA 和基因組DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與pMD18-T 載體進(jìn)行連接，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)程序，三級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用SWISSMODEL（https://swissmodel.ex pasy.org/interactive/）；蛋白序列相似性分析運(yùn)用LALIGN（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/）；基因結(jié)構(gòu)分析運(yùn)用Simple Modular Architecture Research Tool（http://smart.embl-heidelberg.de/）。

1.2.3 進(jìn)化樹(shù)分析 利用 Clustal W 對(duì)草菇、雙孢蘑菇、香菇、巴西蘑菇（Agaricus blazei）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的PPO 氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，并在 MEGA7 軟件中使用鄰位相連法（Neighborjoining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)［14］，并進(jìn)行1 000 次抽樣置換檢測(cè)。

1.2.4 VvPPO 基因家族表達(dá)分析 以草菇不同發(fā)育時(shí)期和蛋形期不同組織部位的cDNA 為模板，以VvTUBα為內(nèi)參［15］，反應(yīng)引物見(jiàn)表1。采用擎科2×T5 Fast qPCRMix (SYBRGreen)試劑盒，PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、58 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量［16］。

表1 供試引物信息Table 1 Information of tested primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 VvPPO 基因家族的獲得

測(cè)序結(jié)果表明，VvPPO1CDS 全長(zhǎng)1 596 bp（圖1 A），含7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子；VvPPO2CDS 全長(zhǎng)2 685 bp（圖1B），含9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子；VvPPO3CDS 全長(zhǎng)1 593 bp（圖1C），含7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子；VvPPO4CDS 全長(zhǎng)2 067 bp（圖1D），含14 個(gè)外顯子和13 個(gè)內(nèi)含子。

2.2 VvPPO 基因家族編碼蛋白質(zhì)特征分析

ProParam 分析表明，草菇PPO 基因家族所編碼蛋白的氨基酸數(shù)目在530～894 之間，相對(duì)分子量最小的是VvPPO1，最大的是VvPPO2；理論等電點(diǎn)pI 范圍5.34～5.95；蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明草菇PPO 蛋白為不穩(wěn)定蛋白；總平均疏水指數(shù)均為負(fù)值，表明4 個(gè)草菇PPO 蛋白為親水蛋白（表2）。

表2 VvPPO 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of physical and chemical properties of VvPPO gene family

SMART 分析表明，4個(gè)草菇PPO 蛋白的Tyrosinase 結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度為236～335 個(gè)氨基酸（圖2）。雙孢蘑菇 PPO 催化活性中心都包括2 個(gè)保守的含銅結(jié)構(gòu)域CuA 和CuB，其中含高度保守的3 個(gè)組氨酸，蛋白序列比對(duì)顯示草菇PPO 蛋白，酪氨酸酶CuA 和CuB 結(jié)合位點(diǎn)保守（圖3）。Swiss-model 分析表明，三級(jí)結(jié)構(gòu)中間有2 個(gè)銅離子結(jié)合域（圖4）。

2.3 VvPPO 蛋白的同源比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析

蛋白序列相似性分析顯示（表3），VvPPO蛋白序列相似度介于48.1%～73.5%，其中VvPPO1與VvPPO3 最高相似度為63.1%，VvPPO2 與VvPPO4 最高相似度為73.5%。將草菇PPO 蛋白序列與雙孢蘑菇、香菇、巴西蘑菇、煙曲霉、粗糙脈孢菌PPO 蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，VvPPO1、VvPPO3 與雙孢蘑菇、香菇、巴西蘑菇PPO 聚為一類(lèi)，VvPPO4 與煙曲霉聚為一類(lèi)，VvPPO2 單獨(dú)聚為一類(lèi)（圖5）。

表3 VvPPO 蛋白序列相似性Table 3 Sequence similarity of VvPPO Proteins

2.4 VvPPO 基因家族表達(dá)分析

VvPPO基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量分析表明，4 個(gè)多酚氧化酶基因在草菇各個(gè)發(fā)育時(shí)期中都有表達(dá)。VvPPO1在原基期表達(dá)量最高，隨著發(fā)育的成熟表達(dá)量逐漸降低；VvPPO2在菌絲期表達(dá)量最高；VvPPO3在原基期表達(dá)量最高，其在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式和VvPPO1較為相似；VvPPO4在菌絲期表達(dá)量最低，蛋形期表達(dá)量最高（圖6 A）。VvPPO基因在蛋形期不同組織部位的表達(dá)量分析表明，VvPPO1、VvPPO4在外菌膜中表達(dá)量較高，在菌蓋和菌柄中表達(dá)量較低，其中VvPPO1在外菌膜的表達(dá)量要比在菌蓋和菌柄中的表達(dá)量高10 倍以上；VvPPO2、VvPPO3在菌柄中的表達(dá)量較高，在外菌膜和菌蓋中表達(dá)量較低（圖6 B）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)PPO 與果蔬發(fā)生褐變有關(guān)［17］，在大花金雞菊（Coreopsis grandif lora）的研究中發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶AUS1 與aurone 的合成有關(guān)［18］，說(shuō)明PPO 功能的多樣性。草菇PPO 家族蛋白序列相似性分析顯示，草菇VvPPO1 與VvPPO3 相似度較高，在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式也較相似；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示VvPPO2 與另外3 個(gè)草菇PPO蛋白結(jié)構(gòu)差異明顯；草菇PPO 蛋白序列與雙孢蘑菇、香菇、巴西蘑菇、煙曲霉、粗糙脈孢菌PPO序列進(jìn)化分析結(jié)果顯示，VvPPO2 單獨(dú)聚為一類(lèi)，說(shuō)明VvPPO2 與另外3 個(gè)PPO 生物功能不同。

不同的PPO基因表達(dá)模式不同，在植物不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量差異明顯，且PPO的表達(dá)還受到生物和非生物脅迫的影響［19］。雙孢蘑菇的發(fā)育過(guò)程中，子實(shí)體時(shí)期PPO 的活性增強(qiáng)，菌蓋表面褐變程度與PPO 活性呈正相關(guān)關(guān)系［6］。對(duì)VvPPO基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，除VvPPO2外，其他草菇PPO基因在菌絲期表達(dá)量較低，原基形成后表達(dá)量迅速升高，到成熟期時(shí)表達(dá)量漸漸降低，在蛋形期的不同組織部位表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，在蛋形期PPO 在各個(gè)組織部位均有表達(dá)。VvPPO1和VvPPO4在外菌膜中的表達(dá)量最高，可能是蛋形期引起草菇褐變的關(guān)鍵基因。VvPPO2在外菌膜中表達(dá)量最低，在菌柄中表達(dá)量最高，VvPPO2在各個(gè)組織部位的表達(dá)量差異不明顯，這意味著草菇PPO 功能的差異。

在果蔬抗褐變的研究中以PPO基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行基因編輯已經(jīng)獲得了抗褐變的蘋(píng)果（Malus sieversii）、茄子（Solanum melongena）和馬鈴薯（Solanum tubersoum）［20-22］等，如在馬鈴薯中通過(guò)編輯多酚氧化酶基因StPPO2獲得了多酚氧化酶活性降低63%、酶促褐變降低73%的植株。在雙孢蘑菇中通過(guò)編輯PPO基因獲得了抗褐變雙孢蘑菇［12］，本研究初步分析了草菇PPO基因家族的特征和表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示草菇褐變的發(fā)生機(jī)理、培育抗褐變草菇提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于草菇基因組數(shù)據(jù)，挖掘獲得4個(gè)多酚氧化酶基因，蛋白序列分析顯示4 個(gè)草菇PPO 蛋白中菌含有保守Tyrosinase 結(jié)構(gòu)域，具有PPO 蛋白典型特征，含有銅離子A(CuA)和 B(CuB) 結(jié)合區(qū)。同源比對(duì)與進(jìn)化分析顯示VvPPO1與VvPPO3 相似性較高，VvPPO4 與煙曲霉同源性較高，VvPPO2 單獨(dú)聚為一類(lèi)，表明它們可能具有不同功能。草菇PPO基因表達(dá)模式分析顯示VvPPO1、VvPPO3與VvPPO4子實(shí)體時(shí)期表達(dá)量比菌絲期表達(dá)量高，VvPPO2在各個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量變化不明顯。在蛋形期外菌膜中VvPPO1和VvPPO4表達(dá)量較高，VvPPO1和VvPPO4可能與蛋形期草菇褐變有關(guān)。