基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留

宋 磊

（貴州醫(yī)科大學(xué)，公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州貴陽 550025）

雞蛋蛋黃中的卵磷脂、甘油三酯、膽固醇和卵黃素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和身體發(fā)育有益，還能改善記憶力，雞蛋中的蛋白質(zhì)能夠修復(fù)肝臟組織損傷[1]。在養(yǎng)殖過程中，獸藥能預(yù)防和治療疾病，這些藥物在使用過程中會(huì)直接或間接地進(jìn)入雞體內(nèi)，對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。氟蟲腈主要用于防治多種害蟲[2]，但是氟蟲腈會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成影響，所以我國規(guī)定2009年10月1日起禁用氟蟲腈[3]。

QuEChERS法具有快速、簡便、廉價(jià)、有效、耐用、安全，是近年來應(yīng)用日趨廣泛的萃取技術(shù)，已被逐步用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[4-5]。氟蟲腈類藥物的測(cè)定方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。UPLC-MS/MS在獸藥殘留檢測(cè)方面具有強(qiáng)的定性和定量分析能力，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥和獸藥殘留的檢測(cè)[6-8]。本研究通過試驗(yàn)探究QuEChERS方法結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)雞蛋中氟蟲腈類抗菌藥物殘留的試驗(yàn)條件，建立了一種快速、有效、簡便的測(cè)定雞蛋中氟蟲腈類藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水；無水硫酸鎂、氯化鈉（徐州淞譽(yù)化工科技有限公司）；C18購買于美國Waters公司；氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟甲腈和氟蟲腈硫醚標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 μg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）。

儀器：Waters TQ MS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；HC-3515高速離心機(jī)（日本日立公司）；Milli-Q超純水凈儀（美國密理博公司）；KQ-500V數(shù)控超聲波清洗器；數(shù)顯渦旋振蕩器（美國賽默飛公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟甲腈、氟蟲腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容配成濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3）溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，濃度為1.0 μg/mL，用流動(dòng)相初始比例逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按照相同系列濃度配制。

1.2.2 樣品前處理

稱取雞蛋樣品2.00 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水（9∶1，V/V）（含0.5%甲酸）作為提取溶劑，旋渦振蕩均勻，加入1 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩3 min，超聲提取10 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心 5 min，吸取上清液加入含有10 mg C18凈化管中，手動(dòng)劇烈振蕩3 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心5 min，0.22 μm濾膜過濾后，UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 μm，100 mm×2.1 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～6 min，10%～30% A；6～ 9 min，30%～50% A；9～9.5 min，50%～100% A；9.5～ 12.5 min，100% A；12.5～15 min，100%～10% A。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧電離源，負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，去溶劑溫度和離子源溫度分別為400 ℃和150 ℃，碰撞氣體（氬氣）和去溶劑氣體（氮?dú)猓┝髁糠謩e為0.14 L/min和800 L/h。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4種流動(dòng)相在相同梯度洗脫條件，對(duì)氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結(jié)果表明，4種化合物在不同體系中相應(yīng)值比較為：甲醇-水＜甲醇-0.1%甲酸溶液＜乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液，故選擇含有乙腈體系的流動(dòng)相；試驗(yàn)對(duì)4種化合物在不同體系中的峰形進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)含有甲酸組的對(duì)稱性優(yōu)于不含甲酸組的。因此，本研究選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

用甲醇分別配制氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的濃度為200 ng/mL，通過質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行MS掃描，優(yōu)化毛細(xì)管電壓和碰撞能量，選擇響應(yīng)豐度較高、干擾較少的作為定量離子對(duì)。質(zhì)譜參數(shù)見表1；氟蟲腈藥物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 氟蟲腈藥物色譜圖

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

選擇雞蛋為試驗(yàn)樣品，考察了甲醇/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）（含0.1%甲酸）、乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）和乙腈/水（9∶1）（含1%甲酸）5種提取溶劑對(duì)氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的提取效果。結(jié)果表明，含有乙腈組分的提取劑對(duì)組織滲透力強(qiáng)，對(duì)目標(biāo)物提取效果好，且沉淀蛋白質(zhì)及脂肪能力強(qiáng)，因此本試驗(yàn)選取乙腈作為提取溶劑。隨著甲酸含量的加入，有利于目標(biāo)物提取，當(dāng)加入量超過0.5%時(shí)，提取效率明顯降低。因此，選擇乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）為本試驗(yàn)的提取溶劑，提取回收率在78%～107.4%。

2.3 鹽析劑的優(yōu)化

加入無水MgSO4可促使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取回收，同時(shí)能吸取提取溶劑中的水分，促進(jìn)目標(biāo)化合物溶解在乙腈層；加入氯化鈉有利于水相和有機(jī)相分離，降低目標(biāo)物在水層中的溶解度，更加有利于藥物的提取。本文考察了9組鹽析劑無水硫酸鎂和氯化鈉的組合，分別為2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在雞蛋空白樣品濃度為0.02 mg/kg添加水平下，隨著無水硫酸鎂含量增加，氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜回收率逐漸變大，當(dāng)無水硫酸鎂含量為1.0 g時(shí)，4種目標(biāo)物的回收率為78%～107.4%，再次增加無水硫酸鎂質(zhì)量時(shí)，4種目標(biāo)物的回收率出現(xiàn)明顯下降；而在試驗(yàn)中選取的氯化鈉的添加質(zhì)量在1 g時(shí)，4種目標(biāo)化合物的回收率最高。可能由于無水硫酸鎂和氯化鈉含量增加，造成失水嚴(yán)重而目標(biāo)物被包裹在鹽析劑空隙中。因此，選擇1 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉為鹽析劑。

2.4 凈化劑含量的優(yōu)化

C18作為凈化劑，可以去除雞蛋樣品中脂肪、維生素和甾醇等非極性物質(zhì)，降低雜質(zhì)的影響，減小基質(zhì)效應(yīng)，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)考察了加入量分別為5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的凈化劑C18對(duì)氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜的影響。研究證明C18為10 mg時(shí)，添加濃度為0.02 mg/kg，獸藥的回收率范圍在78%～107.4%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

按如下公式計(jì)算評(píng)價(jià)基質(zhì)對(duì)各化合物的基質(zhì)效應(yīng)：

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；A為初始流動(dòng)相溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；B為基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。若20%＞ME＞-20%，則為基質(zhì)效應(yīng)可以接受，否則存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)[9]。根據(jù)表2可知，4種藥物在雞蛋中的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)（20%＞ME＞-20%），為了定量準(zhǔn)確，選擇基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

表2 基質(zhì)效應(yīng)、線性方程和相關(guān)系數(shù)

由表2可知，氟蟲腈及其代謝物在10～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)r≥0.995。以S/N=3和S/N=10計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種目標(biāo)化合物的LOD和LOQ分別為0.162～0.685 μg/kg和0.541～ 2.285 μg/kg，滿足雞蛋中多種獸藥殘留的測(cè)定需求。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

在雞蛋空白樣品添加濃度為0.02 mg/kg水平下，進(jìn)行8次平行試驗(yàn)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，由表3可知，4種化合物的平均加標(biāo)回收率在78.0%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.93%～5.66%，方法具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

表3 加標(biāo)樣品回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=8）

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

樣品《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.115—2018）和本方法同時(shí)檢測(cè)1個(gè)陰性樣品和2個(gè)陽性樣品，獲得的結(jié)果是一致的，同時(shí)做加標(biāo)質(zhì)量控制樣品，4種藥物的回收率在75%～112%范圍內(nèi)。樣品中檢測(cè)出氟甲腈，其余藥物均未檢出。根據(jù)結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)的結(jié)果差異小。

3 結(jié)論與討論

本文建立了基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物殘留方法。本方法快速、簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確，可用于檢測(cè)雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物殘留同時(shí)測(cè)定。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)及農(nóng)業(yè)部公告相比，該方法能實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)的多類獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)周期，節(jié)約了檢測(cè)成本，為相關(guān)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。